Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

El objetivo general de este experimento es lograr una alta eficiencia de transfección en células madre pluripotentes inducidas humanas mediante el uso de protocolos optimizados de transfección y afectación nuclear. Esto se consigue primero estableciendo cultivos libres de células alimentadoras de células madre pluripotentes inducidas humanas. Para la transfección, las células madre pluripotentes inducidas humanas se siembran sobre gelatina, TRX o matrigel durante la noche.

Aunque para la transfección nuclear se obtienen pequeños agregados celulares mediante tripsina, se añade una mezcla de ADN plasmídico y reactivo de transfección GeneJuice a las células en placas, luego se centrifuga la placa y se incuba a 37 grados Celsius. La suspensión de células iPS humanas se transfecta nuclearmente en un dispositivo de transfección nuclear, y las células se resuspenden en medio condicionado con metionina y se incuban a 37 grados Celsius. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran una manipulación genética eficiente mediante una alta eficiencia de transfección en células iPS humanas.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la electroforesis de transfección y los métodos de afectación nuclear descritos previamente es que en nuestro laboratorio se puede lograr rutinariamente una alta eficiencia de transfección en células IPS humanas con resultados consistentes. Nuestros protocolos también garantizan una muerte celular mínima tras la modificación genética. Por lo tanto, nuestros protocolos permiten una generación rápida y a gran escala de líneas celulares transgénicas de IPS humanas. Antes de adaptar las células madre pluripotentes inducidas humanas a cultivos libres de alimentadores, prepare placas recubiertas con gelt TRX.

A continuación, masajee los IPC humanos previamente mantenidos sobre células alimentadoras con un mililitro de acitretino por pocillo e incube a 37 grados Celsius durante un minuto y hasta que la mayoría de las células comiencen a desprenderse; agregue 10 a 15 bolitas de vidrio a las células y agite suavemente la placa. Luego, añada dos mililitros de D-M-E-M-F 12 sin suero y triture suavemente. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 10 mililitros.

Centrifugar las células a 800 RPM durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, dejando intacto el pellet de IPSC humanas. Agitar suavemente el tubo para dispersar el pellet celular con cuidado.

Reese, suspenda el pellet de iPSC humanas en un volumen adecuado de medio STEM pro y distribúyalo entre los pocillos de una placa recubierta con gel TRE. Dependiendo de la tasa de proliferación, las iPSC humanas pueden pasarse en una proporción de división de uno a dos, hasta uno a seis. Coloque cuidadosamente la placa en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius y agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células en los pocillos.

Alimente las células diariamente. Cuando las células alcancen una confluencia del 80 %, estarán listas para ser nuevamente pasadas a un nuevo gel. Un pocillo recubierto con Rex, sembrado a una proporción de división de uno a dos, debe presentar aproximadamente entre el 40 y el 50 % de confluencia y colonias pequeñas distribuidas uniformemente en el pocillo recubierto con gel el día de la transfección, para lograr una eficiencia óptima de transfección.

Para comenzar este procedimiento, prepare 100 microlitros de medio de eliminación génica en un tubo estéril de 1,5 mililitros con extremo cónico. Añada 27 microlitros del reactivo de transfección Gene Juice, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada cuatro microgramos de ADN plasmídico.

La elección del plásmido es fundamental para lograr una eficiencia de transfección óptima. El plásmido utilizado aquí posee una proteína verde fluorescente mejorada controlada por un promotor CAG, que es un promotor fuerte y activo transcripcionalmente en las IPC humanas. Incube el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de 15 minutos, agregue la mezcla de gene juice y ADN a las células e incube la placa. Centrifugue la placa a 1.200 RPM durante cinco minutos para aumentar el contacto de la mezcla de transfección con las IPC humanas en el pocillo. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche al día siguiente.

Monitoree la eficiencia de transfección el día de la transfección nuclear; pretrate los IPC humanos con un inhibidor de ROCK de 10 micromolar durante al menos una hora a 37 grados Celsius mientras se pretatan las células IPS humanas. Prepare 82 microlitros de solución efectora nuclear para células madre humanas en un tubo eppendorf estéril de 1,5 mililitros. Añada 80 microlitros.

Añada un suplemento y mezcle bien mediante pipeteo. Incube la solución a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Precaliente, previamente preparado, medio condicionado de células alimentadoras y tripsina al 0,25 % en EDTA a 37 grados Celsius bajo la campana extractora.

Preetiquete un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Retire cuidadosamente el medio de la cultura de iPSC humanas que se va a nuclear afectar y lave suavemente las células con solución salina tamponada con fosfato. Aspire el PBS y añada tripsina; incube las células a 37 grados Celsius durante tres minutos.

Para una nucleofección exitosa, es fundamental no tratar las células con tripsina para obtener células individuales. En cambio, las células deben ser trituradas en pequeños agregados que consten de dos a tres células. Resuspenda suavemente las células con una punta de pipeta P1000 en pequeños agregados que consten de dos a tres células.

Lave el fondo del pocillo mediante pipeteo repetido para asegurarse de que todas las IPC humanas se hayan desprendido completamente. Luego, transfiera la suspensión celular al tubo cónico de 15 mililitros etiquetado. A continuación, agregue nueve mililitros de medio para fibroblastos embrionarios de ratón.

Para inactivar la tripsina, centrifugar las células a 800 RPM durante tres minutos. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante dejando intacto el botón celular. Suspender las células en 100 microlitros de una solución efectora nuclear de células madre humanas precalentada.

Utilizando una punta de pipeta de un mil mililitro, transfiera las células a un vial de efector nuclear. Añada cuatro microgramos de ADN plasmídico a la suspensión celular en el vial; mezcle las células y el ADN mediante agitación suave en remolino. Toque ligeramente el vial dos veces sobre la superficie de la campana.

Inserte el vete en el soporte del efector nuclear del dispositivo de efector nuclear. Seleccione las células de efecto nuclear con el programa B 0 1 6 pulsando el botón x. Aparecerá la indicación «Okay» cuando finalice el proceso de afectación nuclear, lo cual suele tardar entre uno y cinco segundos. Utilice la pipeta de plástico proporcionada en el kit de afectación nuclear para recuperar las células afectadas del vete; recupere las células mediante Resus, suspendiéndolas en CM precalentado e inhibidor de rock en un tubo estéril de 1,5 mililitros. Incube las células a 37 grados Celsius durante 10 minutos.

Después de 10 minutos, utilice una punta de pipeta de un mililitro para transferir las células gota a gota sobre las capas de alimentación. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche al día siguiente. Monitoree la eficiencia de transfección.

Se muestran aquí microfotografías de células de IPSC humanas RIV que expresan EGFP, transfectadas mediante Gene Juice en Gel Rex 12 horas después de la transfección con plásmido. Transfección de ADN en IPs humanas. El uso de Gene Juice con un promotor fuerte generalmente produce más del 60 % de células que expresan el reportero EGFP en un ensayo de transfección transitoria.

Las células que expresan EGFP también se pueden obtener mediante transfección nuclear, como se ilustra en estas imágenes de IPC humanos RIV cultivados y formados sobre alimentadoras tras la transfección nuclear utilizando ya sea el programa de transfección nuclear B 0 1 6 o el programa de transfección nuclear A 0 2 3. El uso del programa B 0 1 6 da como resultado hasta un 80 % de células positivas para EGFP, mientras que el programa A 0 2 3 produjo menos del 10 % de células positivas para EGFP. Además, se pueden obtener clones estables de CIPSc humanos transgénicos que expresan el gen de interés.

Un ejemplo de colonias de IPSC humanas que expresan de forma estable EGFP con expresión ubicua de EGFP derivadas de gene juice se muestra aquí. Estas células conservan la expresión constitutiva de EGFP durante la diferenciación en cuerpos embrionarios. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la nucleofección y transfectar células IPS humanas.

La manipulación genética eficiente es una herramienta esencial para estudiar diversos aspectos de la biología de las células madre y acelerará el uso de líneas celulares IPS humanas en medicina regenerativa.