Aislamiento de células gliales entéricas de la submucosa y la lámina propia de un ratón

Tome un segmento del intestino delgado de ratón previamente despojado del músculo longitudinal y el plexo mientérico, las capas que contienen neuronas entéricas y las células gliales.

Corta el tejido y colócalo en un tampón que contenga EDTA. Incubar con balanceo.

El EDTA interrumpe las uniones célula-célula, separando la mucosa epitelial de la lámina propia subyacente y las capas de tejido conectivo submucosas que contienen células gliales entéricas.

Pipetear repetidamente para desalojar las células epiteliales.

Filtre a través de un filtro de celdas y deseche el flujo.

Transfiera el tejido a un tampón de disociación no enzimática e incube con balanceo. El tampón de disociación afloja la lámina propia y la matriz extracelular submucosa, desprendiendo las células.

Pipetear repetidamente para disociar aún más las células.

Filtre a través de un filtro celular para recolectar las células.

Centrifugar y volver a suspender las células en un tampón.

Tome pocillos recubiertos de proteínas de adhesión que contengan un medio de crecimiento glial y coloque las células en placas.

El recubrimiento facilita la adhesión celular, mientras que los factores de crecimiento promueven selectivamente la proliferación de células gliales, estableciendo una lámina propia y un cultivo de células gliales submucosas.

Para eliminar la mucosa epitelial, primero, use unas tijeras finas para cortar los intestinos en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros y recoja los trozos en 30 mililitros de solución helada de EDTA / HEPES / DPBS. Agite la solución que contiene tejido a 4 grados Celsius durante 10 minutos a aproximadamente 60 inclinaciones por minuto.

Humedezca previamente una pipeta de plástico de 5 mililitros pipeteando el tampón EDTA/HEPES/DPBS hacia arriba y hacia abajo una vez, y luego use la pipeta prehumedecida para triturar el tejido y la suspensión tampón 20 veces para desalojar la mucosa epitelial.

Recoja el tejido vertiendo la mezcla a través de un colador de células de nailon de 100 micras y use pinzas de punta fina para colocar el tejido retenido en el colador en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros que contiene 30 mililitros de EDTA / HEPES / DPBS helados. Repita la incubación de EDTA / HEPES / DPBS por segunda vez balanceando el tejido a 4 grados Celsius durante 10 minutos a aproximadamente 60 inclinaciones por minuto para eliminar la mucosa epitelial adicional.

Realice una trituración suave con una pipeta de 5 mililitros prehumedecida. El tejido tenderá a adherirse al interior de la pipeta a medida que se elimine más epitelio.

En este punto se requiere una trituración suave, ya que las células gliales entéricas son más frágiles.

Recoja el tejido después de la segunda incubación vertiendo la mezcla a través de un colador de células de nailon de 100 micras y deseche el flujo. El segundo flujo debería ser notablemente menos turbio que el primero. Repita las incubaciones de EDTA de 10 minutos hasta que la solución esté casi clara.

Transfiera el tejido del colador de nailon a un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros que contenga 5 mililitros de la solución de recuperación celular disponible comercialmente. Luego, balancee durante 25 a 30 minutos a 4 grados centígrados. Triture suavemente 10 veces para disociar las células gliales entéricas de la lámina propia, luego filtre a través de un filtro de 40 micras y recoja el filtrado en un tubo limpio de 50 mililitros.

Enjuague el pañuelo en el filtro de nailon con 1 mililitro de DPBS. Deseche el tejido y transfiera los 5 a 6 mililitros de filtrado a un tubo de centrífuga cónico limpio de 15 mililitros. Centrifugar el filtrado a 2.000 veces g en una centrífuga de cubo oscilante durante cinco minutos a 4 grados centígrados.

Vuelva a suspender el gránulo que contiene células gliales en al menos 1 mililitro de tampón de resuspensión pipeteando suavemente el gránulo hacia arriba y hacia abajo con la punta de pipeta de 500 microlitros sin introducir burbujas. Finalmente, coloque placas en las células gliales entéricas agregando 200 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de laminina o 100 microlitros en cada pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga medios de crecimiento glial.