Un método para el aislamiento de unidades neurovasculares a partir de cerebro de rata

Comience con un mortero de vidrio frío que contenga tejido cerebral cortical de rata, que es la capa más externa del cerebro.

Agregue un tampón de microvasos cerebrales o BMB, que contenga inhibidores de la proteasa.

Ahora, mueva el mortero hacia arriba y hacia abajo para disociar el tejido.

Esta agitación libera las unidades neurovasculares, o NVU, que comprenden microvasos, pericitos, neuronas y células gliales. Los inhibidores de la proteasa bloquean las proteasas liberadas, protegiendo los microvasos.

Transfiera esta mezcla a un tubo.

Agregue una solución densa de polisacáridos. Use un vórtice para mezclar la solución con otros contenidos de manera uniforme.

centrífuga. Los polisacáridos densos permiten la sedimentación de NVU, que son más densos que los restos de tejido.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las NVU en BMB que contengan inhibidor de proteasa y solución de polisacáridos.

Usa el vórtice para mezclar el contenido.

Repita el proceso de centrifugación. Deseche el sobrenadante para eliminar cualquier residuo residual.

Vuelva a suspender las NVU en BMB y guárdelas para su posterior análisis.

Coloque el tejido cerebral cortical en un mortero de vidrio frío. Luego, agregue 5 mililitros de BMB con cóctel inhibidor de proteasa. Con un homogeneizador de potencia superior, inserte un mortero en el mortero y homogeneice el tejido cerebral con 15 movimientos hacia arriba y hacia abajo a 3,700 RPM. Luego, vierta el homogeneizado en tubos de centrífuga etiquetados. Entre muestras, use etanol al 70% para limpiar el mortero.

Para llevar a cabo la centrifugación, agregue 8,0 mililitros de solución de dextrano al 26% a cada tubo de centrífuga marcado que contenga homogeneizado cerebral. Invierta el tubo dos veces y luego haga un vórtice completo de la muestra. Realice el vórtice de cada muestra utilizando múltiples ángulos para garantizar una mezcla completa de la solución de homogeneizado cerebral con una solución de dextrano al 26%. Centrifugar las muestras a 5.000 g y 4 grados centígrados durante 15 minutos.

Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 5,0 mililitros de BMB con cóctel de inhibidores de proteasa. Luego, agite el gránulo para asegurar una mezcla completa. A continuación, agregue 8,0 mililitros de dextrano al 26% a cada tubo de centrífuga y vórtice como se acaba de demostrar. Luego, centrifuga las muestras nuevamente.

Con un matraz de vacío y una pipeta de vidrio, aspire el sobrenadante y asegúrese de que el gránulo que contiene el microvaso cerebral no se rompa. Vuelva a suspender el gránulo en BMB con inhibidor de proteasa y luego dextrano al 26% dos veces más. Después de la centrifugación final, agregue 5.0 mililitros de BMB a cada gránulo y vórtice para volver a suspender la muestra.