Una técnica para recolectar y disociar ganglios de la raíz dorsal para cultivos neuronales

Tome una sección de la columna vertebral de una rata y divídala para extirpar la médula espinal.

Separar los ganglios de la raíz dorsal, o DRG, un grupo de neuronas rodeadas de células gliales satélite o SGC.

Coloque los DRG en un medio de cultivo. Retire las raíces nerviosas para reducir la contaminación por SGC.

Tratar con colagenasa para degradar la matriz tisular y lavar para eliminar las enzimas.

Introducir tripsina para interrumpir las conexiones intercelulares. Añadir un sérum que contenga proteínas que desactiven la tripsina.

Agregue el medio de cultivo y disocie mecánicamente el tejido. Filtre la suspensión para aislar células individuales y centrifugar para eliminar los restos de tejido.

Vuelva a suspender las celdas para colocarlas en capas en un medio de gradiente de densidad y centrifuge.

Las neuronas con una mayor densidad se asientan en la parte inferior, facilitando la separación de las SGC.

Vuelva a suspender las neuronas en un medio de cultivo. Transfiéralos a un pocillo recubierto de sustrato de cultivo, lo que permite la unión celular.

Complementar con factores de crecimiento nervioso para la supervivencia neuronal.

Para obtener las neuronas DRG después de extraer la médula espinal, comience por extirpar las partes dorsales y luego, use tijeras quirúrgicas estériles y afiladas para dividir la columna vertebral por la mitad a lo largo del eje longitudinal, exponiendo el tejido de la médula. Corte la columna vertebral en dos segmentos más pequeños por debajo del nivel de la caja torácica y luego use pinzas finas para eliminar suavemente todo el tejido del cordón, teniendo cuidado de no tirar y quitar las raíces DRG, que aparecen como filamentos blancos que salen directamente de los canales.

Una vez que se haya eliminado todo el tejido central, use fórceps muy finos para tirar de toda la raíz de DRG, llegando profundamente a los canales vertebrales y teniendo cuidado de no dañar las raíces de los ganglios. Coloque el DRG en una placa de Petri de 60 milímetros cuadrados que contenga de 3 a 4 mililitros de medio F-12 de Ham, complementado con antibióticos. Luego, bajo un microscopio de disección, use fórceps estériles y un bisturí para eliminar el exceso de raíces nerviosas que rodean los ganglios para reducir la contaminación de las células satélite

A continuación, transfiera el DRG a una placa de Petri de 35 milímetros cuadrados que contenga 1,8 mililitros de medio F-12 fresco y agregue 200 microlitros de solución madre de colagenasa tipo 4. Incube el DRG durante una hora y luego aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no aspirar ni dañar el DRG.

Repita el paso de la colagenasa y lave el DRG con medio F-12. Después del segundo lavado, agregue 1,8 mililitros de medio F12 y 200 microlitros de tripsina a las células, eliminando la tripsina y agregando 1 mililitro de medio suplementado con 500 microlitros de FBS para detener la reacción enzimática. Luego, aspire el medio y lave suavemente el DRG con medio F-12 tres veces para eliminar todos los restos del suero.

Ahora, alimente las células con 2 mililitros de medio F-12 fresco y use una pipeta de vidrio para transferir cuidadosamente la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Pipetea hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces para disociar suavemente las neuronas y luego deja que el gránulo se acumule en el fondo del tubo. Cuando el pellet esté asentado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y agregue 2 mililitros de medio F12 fresco al pellet, repitiendo la disociación mecánica y la transferencia del medio hasta que la suspensión se vuelva homogénea.

Luego, triture la suspensión celular de tres a cuatro veces, seguido de la filtración de la suspensión homogeneizada resultante a través de un filtro celular de 100 micrones en un nuevo tubo de 50 mililitros. Centrifugar las células en un tubo de 15 mililitros. Mientras giran, pipetee lentamente albúmina de suero bovino al 15% recién preparada por el interior de un tubo de 15 mililitros sostenido en un ángulo de 45 grados para crear un rastro gradual de proteínas utilizando los números en el tubo como referencia para la pista de formación.

Luego, aspire el sobrenadante de las células, guardando los últimos 500 microlitros para resuspender el sedimento, y dispense lentamente las células a lo largo del rastro de proteínas en el nuevo tubo. Después de volver a girar las células, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de medio BS modificado y siembre las células en un pequeño volumen de medio en una placa de 24 pocillos durante dos horas. Cuando las células se hayan adherido, agregue medio BS fresco complementado con 50 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento nervioso.