Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales de ratón

Agregue tampón al tejido cerebral del ratón y homogeneícelo para liberar células y microvasos.

A continuación, agregue la solución de BSA-dextrano al homogeneizado. Mezclar y centrifugar para separar los componentes. Deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender los microvasos en tampón y páselos a través de un filtro, eliminando los vasos más grandes.

Ahora, centrifuga el filtrado y elimina el sobrenadante. Vuelva a suspender los microvasos en el tampón que contiene ADNasas.

Agregue enzimas proteolíticas para liberar células endoteliales y pericitos.

Las ADNasas degradan el ADN.

Agregue tampón que contenga BSA para detener la actividad enzimática. Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender las celdas en el medio y colóquelas en una placa multipocillo recubierta de matriz basal. Incubar, promoviendo la adhesión celular.

Cambie los medios regularmente.

Las células endoteliales forman una monocapa y apoyan el crecimiento de pericitos.

El paso celular posterior en medios de pericitos en una placa de pocillos múltiples recubierta de gelatina promueve el crecimiento de pericitos al tiempo que elimina las células endoteliales.

Comience colocando el cerebro de un ratón C57 negro negro 6 macho libre de patógenos específicos de cuatro a seis semanas de edad en una toallita estéril, seca y sin pelusa y usando fórceps de punta curva para eliminar el cerebelo, el cuerpo estriado y los nervios occipitales. Use un hisopo de algodón para eliminar todas las meninges visibles y voltee el tejido cerebral. Abra los lóbulos con ligeros movimientos hacia afuera y elimine todos los vasos sanguíneos visibles. Luego, coloque el tejido cerebral libre de meninges en una placa de Petri de 100 milímetros que contenga 15 mililitros de tampón de lavado B frío.

Para homogeneizar el tejido, transfiera la muestra de cerebro a un tubo de mortero Dounce Tissue Grinder y agregue de 3 a 4 mililitros de tampón de lavado B al tubo. Use un mortero suelto para picar el tejido 55 veces. Luego, enjuague el mortero con Washing Buffer B y pique la lechada de tejido con un mortero apretado 25 veces. Al final de la homogeneización, alícuota igualmente la suspensión entre dos tubos de 50 mililitros y agregue 1,5 veces el volumen de albúmina dextrano sérica bovina fría al 30%. Luego, agite vigorosamente los tubos para mezclar la suspensión.

Para aislar la fracción vascular, sedimente las células por centrifugación y transfiera los sobrenadantes a dos nuevos tubos. Guarde el pellet en el tampón de lavado B con hielo. Vuelva a suspender los gránulos en tres mililitros de tampón de lavado en frío B en hielo.

Centrifuga los sobrenadantes cosechados y repite este paso una vez más. Deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender los gránulos en 3 mililitros de tampón de lavado B. Luego, agrupe los gránulos resuspendidos y lleve el volumen final de las suspensiones de celdas agrupadas a 10 mililitros con el tampón de lavado en frío fresco B.

Además, disocie las células con una pipeta de 10 milímetros seis veces hasta que no se vean grupos restantes de gránulos, y use un conjunto de filtro de vacío y un colador de malla de nailon para filtrar la suspensión celular. Coloque el colador en una placa de Petri y limpie la malla con un tampón de lavado B nuevo y raspe para recuperar los capilares. Luego, realice una segunda filtración con un filtro nuevo.

Divida el filtrado en partes iguales entre dos tubos y recoja las células por centrifugación. Después de desechar los sobrenadantes, agrupe los gránulos en un solo tubo que contenga tampón de lavado B precalentado con enzimas y agregue dispasa de colagenasa precalentada al tubo. Coloque el tubo en un baño de agua de mesa vibratoria durante exactamente 33 minutos a 37 grados centígrados antes de detener la reacción con 30 mililitros de tampón de lavado B en frío.

Recoja las células por centrifugación y deseche con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de forma rápida pero cuidadosa en el tampón de lavado B seis veces y vuelva a centrifugar la suspensión. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en mililitros de medio DMEM completo y siembre 2 mililitros de suspensión celular en DMEM completo en nueve pocillos de tres placas de seis pocillos recubiertas de Matrigel.

Coloque los cultivos celulares en una incubadora estéril de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 24 horas antes de retirar cuidadosamente los desechos de cada pocillo y agregue medios DMEM nuevos. Después de 48 horas, cambie el medio en cada pocillo cada 48 horas. En los días 8 a 10, cuando las células alcancen el 100% de confluencia, pase las células en medio de cultivo de parásitos a nuevas placas de seis pocillos recubiertas de gelatina y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 6 a 7 días adicionales con monitoreo.