Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

0 vistas3:51 min • July 8th, 2025

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Comience con un cerebro murino con células neuronales, no neurales e inmunitarias dentro de la matriz extracelular o ECM del cerebro.

Picar el tejido y volver a suspenderlo en un medio de cultivo.

Transfiera estos fragmentos de tejido a un tubo y trátelos con enzimas colagenasa y ADNasa-I.

La colagenasa digiere la ECM, liberando células individuales, mientras que la ADNasa-I degrada el ADN libre para evitar la aglomeración celular.

Luego, agregue EDTA para inactivar las enzimas colagenasa.

Agregue un medio de cultivo. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Agregue una solución de gradiente de densidad y el medio de cultivo al gránulo celular, creando una capa de gradiente de baja densidad.

Mezcle y luego aplique la solución con una solución de gradiente de alta densidad para establecer una diferencia de densidad.

Centrifugar a baja velocidad para separar las células inmunitarias en la interfaz, con restos celulares más ligeros en la parte superior y células neuronales y gliales más pesadas en la parte inferior.

Retire la capa superior, recoja las células inmunitarias y transfiéralas a otro tubo.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante, luego volver a suspender las celdas en un medio, formando una suspensión de una sola celda para aplicaciones posteriores.

Vierta el cerebro o el tejido de la médula espinal con el medio en una placa de Petri de 100 milímetros y use fórceps para mover el tejido hacia el fondo. Pica el tejido cerebral con una cuchilla de afeitar estéril y recoge el tejido en la parte inferior de la placa. Agregue 3 mililitros de RPMI suplementado con FCS al 10% a la placa de Petri, luego use una pipeta serológica de 10 mililitros para volver a suspender el tejido en el medio y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros.

Agregue colagenasa tipo I y ADNasa I al tejido e incube los tubos en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Invierta los tubos cada 15 minutos para mezclar bien el tejido con las enzimas. Después de la incubación, agregue EDTA a cada tubo para obtener una concentración final de 0,01 molares e incube los tubos durante cinco minutos adicionales para inactivar la colagenasa.

Agregue 9 mililitros de RPMI, complementados con un 10% de FCS a cada tubo, luego, centrifugue los tubos a 450 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Utilice una pipeta Pasteur al vacío para aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tocar el sedimento celular.

Agregue 3 mililitros de solución de gradiente de densidad isotónica 100% madre al gránulo celular. Luego, agregue medios FCS RPMI 10% adicionales para llevar el volumen final a 10 mililitros y vuelva a suspender el sedimento celular. Invierta y mezcle bien el tubo. A continuación, inserte una pipeta serológica con 1 mililitro de solución de gradiente de densidad isotónica madre al 70% en el fondo del tubo.

Aplique lentamente la solución con la capa inferior, teniendo cuidado de no formar burbujas. Retire la pipeta serológica del tubo, asegurándose de no alterar el gradiente. Centrifugar el tubo a 800 g durante 30 minutos a 4 grados centígrados, luego aspirar el sobrenadante, incluida la capa de restos de mielina hasta que queden de 2 a 3 mililitros en el tubo.

Utilice una pipeta de 1 mililitro para recolectar la capa celular entre el gradiente de densidad del 30% y el 70% y transferirla a un nuevo tubo de 15 mililitros. Agregue medios FCS RPMI al 10% para llevar el volumen final a 15 mililitros, luego centrifugue las celdas a 450 g durante 5 minutos a 4 grados Celsius.

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Última actualización: 22 agosto 2026