Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:45 min. • July 8th, 2025
Tome una raíz nerviosa y córtela en trozos pequeños.
Transfiera a un tubo que contenga enzimas digestivas e incube.
La enzima digiere la matriz extracelular.
Agregue medios que contengan suero para detener la digestión.
Pipetee el contenido repetidamente, luego centrifugue y deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo.
Pase la suspensión a través de un colador para eliminar el tejido no digerido. Incube las células recolectadas en un plato.
Las células de fibroblastos y Schwann o SC se adhieren a la placa y se dividen.
Retire las células no adheridas. Lave las celdas adheridas con un tampón de fosfato.
Agregue enzimas digestivas para aflojar los SC sensibles a la digestión. Detenga la digestión con medios.
Desconecte completamente los SC agregando medios.
Transfiera las células a un tubo y centrifuge. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en medios específicos para SC.
Transfiera las células a una placa sin recubrimiento e incube.
Los fibroblastos restantes se adherirán, dejando a los SC en suspensión.
Transfiera la suspensión a una placa recubierta de matriz.
Incubar para la unión y división de células de Schwann.
Corta los nervios en trozos de 3 a 5 milímetros con unas tijeras. Agregue 1 mililitro de tripsina al 0,25% y transfiera las piezas nerviosas a tubos de centrífuga de 5 mililitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 18 a 20 minutos. A continuación, para detener la digestión, agregue de 3 a 4 mililitros de DMEM que contengan un 10% de suero bovino fetal. Pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente, unas 10 veces. Centrifugar a 800 veces g durante 5 minutos.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado en 2 a 3 mililitros de DMEM suplementado con FBS al 10%. Filtre la suspensión celular a través de un filtro de malla 400 y luego use la suspensión para inocular una placa de Petri de 60 milímetros. Incube las placas de Petri durante 4 a 5 días a 37 grados centígrados en presencia de dióxido de carbono al 5%.
Cuando el cultivo haya alcanzado el 90% de confluencia, lave las células una vez con 1X PBS. Luego, para digerir las células de Schwann, agregue 1 mililitro de tripsina al 0,25% a 37 grados centígrados por plato de 60 milímetros. Después de 8 a 10 segundos a temperatura ambiente, detenga la digestión agregando 3 mililitros de DMEM suplementados con 10% de FBS. Para separar las células de Schwann, sople suavemente las células con una pipeta.
Verifique con el microscopio que las células estén desprendidas. Luego, recoja el medio, que contiene las células de Schwann, y centrifugue a 800 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado en 3 mililitros de medio. Use la suspensión para inocular placas de Petri de 60 milímetros no codificadas e incube las placas a 37 grados Celsius durante 30 a 45 minutos. Transfiera el medio, que contendrá las células de Schwann, a un plato mediano recubierto de poli-L-lisina e incube el plato a 37 grados centígrados durante 2 días.