Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:20 min. • July 8th, 2025
Comience agregando una suspensión de células endoteliales de cerebro de ratón al inserto de membrana permeable de una placa transwell.
Agregue un medio de crecimiento al pozo inferior e incube.
Los factores de crecimiento y los nutrientes en el medio ayudan a que las células crezcan como una monocapa.
Retire el medio del pozo inferior y del inserto.
Lave las superficies internas y externas del inserto para eliminar cualquier residuo.
Agregue un medio adherente al inserto y transfiera el inserto a un pocillo recubierto de matriz que contenga células madre y progenitoras neurales corticales primarias, o NSPC, e incube.
Agregue azidoazúcar, un análogo precursor del ácido siálico no natural, tanto a las células endoteliales como a las NSPC, e incube.
Las citocinas y quimiocinas secretadas por las células endoteliales promueven el crecimiento de las NSPC en clones grandes en forma de lámina.
Los azidoazúcares se integran en las estructuras de sialoglicanos en la superficie celular de NSPC, marcando la glicoproteína. Esto permite la identificación de proteínas de la superficie celular en las NSPC expandidas.
Para preparar las células endoteliales, vuelva a suspender un gránulo de células BEND3 de una placa de Petri de 0,10 centímetros al 90% de confluencia con 9 mililitros de medio celular BEND3. Agregue 1 mililitro de la suspensión celular en un inserto de soporte permeable. Agregue otros 2 mililitros de medio BEND3 por pocillo en la cámara inferior de la matriz. Continúe cultivando las células durante un día a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%.
Un día después de colocar las celdas en los insertos, aspire suavemente el medio, primero de la cámara inferior y luego de los insertos. Lave la cara de los insertos tres veces con DMEM precalentado. Lave la superficie exterior de los insertos enjuagando con DMEM precalentado. A continuación, agregue 1 mililitro de AM precalentado en un inserto. Transfiera los insertos a los pocillos con células corticales primarias. Incube el cocultivo a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 12 horas.
Disuelva Ac4ManNAz en DMSO para lograr una concentración de stock de 200 milimolares. Recupere la placa de cocultivo endotelial neural de la incubadora. Agregue 1 microlitro de caldo Ac4ManNAz a cada cámara inferior y 0,5 microlitros por inserto en el cocultivo. Cultive las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 5 días. Mientras las células se cultivan, agregue 100 microlitros de RM por inserto y 200 microlitros de RM por cámara inferior para realimentar las células endoteliales y neurales cada dos días.