Preparación de tubos endoteliales cerebrales a partir de arteriolas parenquimatosas de ratón

Asegure un cerebro de ratón, con el lado ventral hacia arriba, en un plato recubierto de polímero de silicio que contenga tampón.

Diseccionar una sección de tejido del hemisferio alrededor de la arteria cerebral media, o MCA, con el segmento de tejido superior que se extiende más allá del punto de ramificación del Círculo de Willis.

Asegure el tejido con el MCA hacia arriba.

Retire la piamadre, con las arteriolas, que se ramifican desde el MCA.

Asegure la piamadre con las arteriolas. Diseccionar la arteriola y extraer el tejido circundante. Deseche las ramas distales.

Incubar la arteriola en un cóctel de enzimas proteolíticas para facilitar la digestión parcial del segmento.

Reemplace las enzimas con tampón y transfiera el segmento digerido a una cámara que contenga tampón en una platina de microscopio equipada con una pipeta de trituración.

Pipetear la arteriola repetidamente para eliminar la adventicia aflojada y las células del músculo liso, lo que da como resultado un tubo intacto que contiene células endoteliales arteriolares.

Coloque el lado ventral del cerebro hacia arriba en una cámara que contenga una solución de disección fría para aislar las arteriolas parenquimatosas. Para aislar las arterias parenquimatosas, asegure el cerebro aislado con clavos de acero y solución de disección fría en una placa de Petri que contenga un recubrimiento de polímero de silicona con infusión de carbón de más de 50 centímetros de profundidad.

Corte un rectángulo de tejido cerebral de ambos hemisferios con tijeras de disección afiladas y alineadas alrededor del MCA, mientras se asegura de que la parte superior del segmento de tejido esté más allá del punto de ramificación del círculo de Willis. Asegure el tejido cerebral en el plato con el MCA hacia arriba con alfileres de acero. Haga con cuidado una incisión poco profunda cerca de los clavos y retire la pia con pinzas pequeñas, pelando suavemente de un extremo hacia el otro.

Asegure cuidadosamente la pia aislada con arteriolas parenquimatosas ramificadas de MCA en el plato con los alfileres y diseccione cuidadosamente las arteriolas parenquimatosas. Corte las ramas distales restantes y asegúrese de que la arteriola esté limpia sin tejido adherido. Use esta arteria limpia e intacta para la digestión enzimática. Alternativamente, corte cada arteria en dos piezas para la digestión enzimática y preparar los tubos endoteliales, si lo desea.

Para la digestión parcial de los segmentos arteriolares, coloque los segmentos arteriolares intactos en 1 mililitro de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 mililitros que contenga papaína, ditioeritritol, colagenasa y elastasa. Incube los segmentos arteriolares a 34 grados centígrados durante 10 a 12 minutos.

Para aislar el tubo endotelial arteriolar, coloque la pipeta de trituración unida con el inyector de microjeringa en la solución de disociación de la cámara y colóquela cerca de un extremo del segmento del recipiente digerido. Establezca una velocidad dentro del rango de 1 a 3 nanolitros por segundo en el controlador de la bomba para una duración suave del tratamiento. Mientras mantiene un aumento de 100 a 200 veces, retire el segmento arterial en la pipeta y luego inyecte para disociar las células de adventicia y músculo liso. Triture el segmento del vaso hasta que todas las células del músculo liso se disocien y solo las células endoteliales permanezcan como un tubo intacto.