Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:27 min. • July 8th, 2025
Toma una cola de bovino.
Retire el tejido suprayacente y los procesos vertebrales, luego corte transversalmente para obtener segmentos.
Identificar el disco intervertebral o IVD, ubicado entre las placas de crecimiento y las placas terminales vertebrales.
Corte a cada lado del IVD y colóquelo en un plato que contenga una gasa empapada en tampón para mantener la viabilidad del tejido.
Raspe cualquier tejido vertebral adherido y mida la altura del IVD.
Lave con tampón para eliminar los restos de sangre y desinfecte el IVD en un tampón que contenga antibióticos.
Coloque los IVD en cámaras de biorreactores que contengan medios.
La media en el grupo fisiológico tiene glucosa alta, mientras que en el grupo patológico, un medio bajo en glucosa induce la privación de nutrientes.
Coloque las cámaras en el biorreactor.
Para el IVD fisiológico, aplique una carga suave diariamente. Para el IVD patológico, aplique una carga intensa a una tasa más alta diariamente.
Entre las pruebas de carga diarias, permita que los IVD se recuperen en los medios.
Después de todos los procedimientos de carga, mida las alturas de IVD.
Una altura reducida en los IVD patológicos indica una condición degenerativa y proinflamatoria.
Comience enjuagando bien toda la cola bovina con agua del grifo para eliminar la suciedad y el pelo de la superficie. Luego, sumerja la cola en una solución de betadine al 1% durante 10 minutos para desinfectar la superficie. Use un bisturí número 20 para eliminar el tejido blando de la columna caudal para facilitar la identificación de los discos intervertebrales o IVD.
Elimine las apófisis espinosas y transversales de las vértebras con un alicate para extirpar hueso. Corte transversalmente con alicates para huesos a través del medio de cada cuerpo vertebral para obtener segmentos de movimiento individuales, luego coloque los segmentos de movimiento recolectados en una placa de Petri con una gasa humedecida en la solución de Ringer.
Localice el IVD y las vértebras moviendo los segmentos de movimiento suavemente. Luego, identifique la ubicación de la placa de crecimiento tocando y encontrando el lado convexo de la placa terminal ósea. Enfríe la hoja de la sierra de cinta con la solución de Ringer y utilícela para hacer dos cortes paralelos en la placa de crecimiento de los IVD, uno a cada lado.
Transfiera los IVD a una placa de Petri limpia con una gasa limpia humedecida con la solución de Ringer. Raspe el cuerpo vertebral y la placa de crecimiento con la hoja de bisturí, dejando intacta la placa terminal. Coloque las dos superficies planas y paralelas para el procedimiento de carga, y transfiera los IVD raspados a una placa de Petri fresca con gasa humedecida con la solución de Ringer.
Mida la altura y el diámetro del disco con un calibrador. Luego, limpie los coágulos de sangre en el hueso de las vértebras con la solución de Ringer usando un sistema de lavado a chorro. Desinfecte los IVD en PBS y penicilina-estreptomicina al 10%, agitando durante 15 minutos. Enjuague los antibióticos de alta concentración con PBS y penicilina estreptomicina al 1%.
Transfiera los discos a cámaras IVD que contengan 5 mililitros de medio de cultivo IVD y colóquelos en el sistema de biorreactor con una incubadora a 37 grados centígrados con 85% de humedad y 5% de dióxido de carbono. Cultive los discos durante cuatro días dentro de un sistema de biorreactor manteniendo diferentes condiciones de carga según los grupos experimentales.
En el grupo de control fisiológico, cultivar los IVD con medio alto de glucosa utilizando un protocolo de carga de 0,02 a 0,2 megapascales y 0,2 Hertz durante dos horas al día. En el grupo patológico, cultivar los IVD con medio bajo en glucosa utilizando un protocolo de carga de 0,32 a 0,5 megapascales y 5 Hertz durante dos horas diarias.
Entre los procedimientos de carga, coloque los IVD en placas de seis pocillos con 7 mililitros de medio de cultivo IVD para recuperar la hinchazón libre. Mida la altura del disco diariamente con un calibrador después del período de hinchazón libre y después de la carga dinámica durante la duración experimental.