Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en una población de neuronas en red

Semillas de células madre embrionarias de ratón en un plato de baja adhesión que contiene medios de diferenciación.

Incubar bajo rotación para facilitar la agregación celular y la diferenciación en un linaje neuronal.

Transfiera los agregados a un tubo y déjelos asentarse por gravedad. Deseche el papel.

Vuelva a suspender y transfiera los agregados al plato original que contiene medios de diferenciación suplementados con ácido retinoico.

El ácido retinoico induce la expresión génica neuronal, desencadenando la diferenciación en células progenitoras neurales.

Transfiera los agregados a un tubo. Retire el medio y agregue tripsina para disociar los agregados.

Agregue un inhibidor para neutralizar la tripsina.

Pipetear repetidamente para obtener una suspensión celular homogénea. Filtrar la suspensión para eliminar los áridos.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas en el medio.

Siembre las células en un plato recubierto de polímero para facilitar la adhesión celular.

Retire el medio. Agregue medios nuevos que contengan factores de crecimiento para promover la maduración neuronal y formar una población de neuronas en red.

La diferenciación de las ESC en neuronas comienza durante un paso celular de rutina. Disociar las ESC como antes, pero incluir una placa adicional para la diferenciación neuronal. Transfiera 350 microlitros de la suspensión celular a un plato de 10 centímetros de baja adherencia que contenga 25 mililitros de medio de diferenciación.

Coloque el plato en un agitador orbital ajustado a 30 a 45 RPM dentro de una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, e incube durante 48 horas. Después de 48 horas, use una pipeta de 25 mililitros para transferir los agregados celulares diferenciadores a un tubo cónico de 50 mililitros.

Inmediatamente después, agregue 25 mililitros de medio de diferenciación fresco a la placa de Petri. Deje que los agregados se asienten durante dos a cinco minutos, produciendo un gránulo visible de uno a dos milímetros de profundidad. Aspire con cuidado el medio, ignorando las células individuales o los pequeños agregados que aún estén en suspensión, y use una pipeta P1000 para transferir el gránulo celular de regreso a la placa de Petri. Regrese el plato a la coctelera rotativa en la incubadora. Después de otras 48 horas, repita el procedimiento de cambio de soporte. Esta vez, agregue 30 mililitros de medio de diferenciación suplementado con seis micromolares de ácido transretinoico.

El gránulo formado ahora tendrá de dos a cuatro milímetros de profundidad. Después de incubar las células como antes, repita el procedimiento de cambio de medios con suplementos de ácido retinoico por última vez. El pellet tendrá de cuatro a ocho milímetros de profundidad en este punto.

Al día siguiente, prepare las superficies de recubrimiento como se describe en la parte escrita del protocolo. En la tarde del día del siembra, descongelar 5 mililitros de medio de tripsinización NPC prealícuota y un inhibidor de tripsina de soja al 0,1% a 37 grados centígrados. Luego, use una pipeta de 25 mililitros para transferir agregados diferenciadores de la placa de cultivo a un tubo cónico de 50 mililitros.

Deje que los agregados se asienten durante tres a cinco minutos y luego aspire cuidadosamente el medio sin alterar el gránulo. A continuación, lave el gránulo con 5 a 10 mililitros de PBS y, una vez que los agregados se hayan asentado, aspire el PBS y repita el lavado. Después del segundo lavado de PBS, agregue 5 mililitros de medio de tripsinización NPC al gránulo e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos, moviendo suavemente el tubo dos o tres veces durante la incubación.

A continuación, agregue 5 mililitros de inhibidor de tripsina de soja al 0,1% a las células y mezcle rápidamente invirtiendo. Luego, triture suavemente las células de 10 a 15 veces con una pipeta de 10 mililitros hasta que se produzca una suspensión celular relativamente homogénea. Filtre lentamente la suspensión celular a través de un colador celular de 40 o 70 micras colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego, una vez que se haya filtrado toda la suspensión, agregue 1 mililitro de medio N2 al filtro para lavar las celdas restantes a través del colador. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue durante seis minutos a 200 veces g.

Después de aspirar el medio, sin alterar el gránulo, triture en 2 mililitros de medio N2, luego agregue medio N2 hasta un volumen total de 10 mililitros. Centrifugar durante cinco minutos a 200 veces g. Aspirar el medio y repetir el proceso de lavado de pellets, nuevamente, resuspendiendo el pellet en 10 mililitros de medio N2.

Retire una alícuota de las células, cuente con un hemocitómetro y luego repita la centrifugación. Vuelva a suspender las células en medio N2 a una concentración final de 1x por 10⁷ células por mililitro, y coloque en una placa a una densidad de 150,000 a 200,000 células por centímetro cuadrado en placas preparadas a DIV menos 1, y colóquelas en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius. Mantenga las ESN de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito.