Una técnica para aislar núcleos de células no neuronales en el giro dentado del hipocampo

Tome la circunvolución dentada de un cerebro de ratón en un tampón de homogeneización en frío.

Disociarse mecánicamente para liberar neuronas, glía y células madre.

El detergente suave del tampón permeabiliza las células, liberando núcleos y otros orgánulos.

Filtrar el homogeneizado para eliminar los restos de tejido. Luego, centrifuga, retira los orgánulos y vuelve a suspender en el tampón de homogeneización para lisar las células intactas.

Centrifugar nuevamente, eliminar el sobrenadante que contiene los orgánulos liberados y volver a suspender los núcleos en un tampón de lavado.

Filtrar para eliminar cualquier residuo, centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Introduzca una tinción de ADN fluorescente para marcar todos los núcleos y un anticuerpo conjugado con fluoróforo que se une al antígeno nuclear neuronal, o NeuN, que marca los núcleos de las neuronas.

Mediante la clasificación de núcleos activados por fluorescencia, identifique agregados con mayor intensidad de fluorescencia de tinción de ADN y mayores propiedades de dispersión, separando los núcleos individuales.

Analizar los núcleos individuales, separando los núcleos neuronales positivos para NeuN y aislando los núcleos negativos para NeuN pertenecientes a la glía y las células madre.

Homogeneizar el tejido con 10 golpes del mortero A suelto, seguidos de 15 golpes del mortero B apretado. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mililitros preenfriado. Enjuague el homogeneizador Dounce con 1 mililitro de HB frío y combínelo con el mismo tubo.

Agregue 3 mililitros de HB al tubo de 15 mililitros e incube durante 5 minutos en hielo. Mezcle esta suspensión de núcleos dos veces invirtiendo el tubo suavemente. Con 0,5 mililitros de HB, humedezca previamente la tapa del colador de 70 micrómetros colocada sobre un tubo de ensayo de 50 mililitros. Luego, cuele la suspensión de núcleos antes de lavar el colador celular con 0,5 mililitros de HB.

A continuación, retire el filtro celular y centrifugue el tubo de ensayo en una centrífuga de cubo oscilante a 500 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente el gránulo en 4 mililitros de HB con una pipeta P1000.

Después de cinco minutos de incubación en hielo, centrifugar la suspensión a 500 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 3 mililitros de medios de lavado. Use 0,5 mililitros de medios de lavado para humedecer previamente una tapa de colador de 35 micrómetros sobre un tubo de ensayo de 50 mililitros. Luego, cuele la suspensión de núcleos pipeteando 0,5 mililitros de suspensión a la vez con una pipeta P1000.

Después de lavar la tapa del colador con 0,5 mililitros de medios de lavado, coloque el tubo en hielo. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de 15 mililitros y centríquelo durante 5 minutos y 4 grados centígrados a 500 g. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 3 mililitros de medios de lavado.

Repita la centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de medio de lavado con el anticuerpo conjugado anti-Neu y AlexaFlour488 de ratón y 1 microgramo por mililitro DAPI. Incube la reacción durante 45 minutos en hielo en la oscuridad.

Para la clasificación de núcleos activados por fluorescencia o FANS, transfiera la suspensión de núcleos inmunoteñidos a un tubo de ensayo de 5 mililitros y colóquela en hielo hasta el inicio del procedimiento de citometría de flujo.

Agite las muestras durante tres segundos con una intensidad suave antes de colocar los tubos en el instrumento FACS.

Para adquirir los datos de la suspensión de núcleos de tinción, establezca las puertas en la altura de DAPI y el área de DAPI para excluir los restos celulares y los núcleos agregados. Luego, coloque las puertas en el área de dispersión lateral logarítmica o SSC y el área de dispersión logarítmica hacia adelante o FSC para separar los núcleos individuales del agregado o los desechos celulares teñidos con DAPI restantes.

Luego, aísle la población negativa a NeuNAF488 estableciendo las puertas para el área anti-NeuNAF488 y FSC.

Después del análisis, clasifique la población anti-NeuNAF488 negativa en un tubo de recolección de 1,5 mililitros lleno de 50 microlitros de medios de lavado utilizando la estrategia de compuerta.