Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:59 min. • July 8th, 2025
Tomemos bacterias modificadas genéticamente en un medio de crecimiento de nematodos.
Las bacterias portan un plásmido con un gen del factor regulador de la cromatina de nematodos.
El medio contiene un inductor que desencadena la expresión de una ARN polimerasa transgénica del genoma bacteriano que transcribe el gen del factor regulador de la cromatina en un dsRNA.
Agregue larvas de nematodos transgénicos que portan un gen del factor de transcripción inductor del destino de las neuronas bajo un promotor de choque térmico.
Tras el consumo bacteriano, el dsRNA ingerido genera siRNA que regula a la baja la expresión del factor regulador de la cromatina, lo que facilita la reprogramación del destino celular.
A través de las células germinales de los padres, el ARNip se transmite a la progenie.
La regulación a la baja de la expresión del factor regulador de la cromatina en las células germinales de la progenie, indicada por un fenotipo de vulva que sobresale, permite su reprogramación.
Aplicar choque térmico a la progenie, activando el promotor del choque térmico y expresando el factor de transcripción inductor del destino neuronal que desencadena la diferenciación neuronal, transformando las células germinales en neuronas.
Las neuronas expresan una proteína reportera fluorescente transgénica, lo que facilita la visualización microscópica.
Transfiera manualmente 50 gusanos L4 por réplica a una placa de ARNi NGM. Usa un alambre de platino. Los gusanos L4 se pueden reconocer por una mancha blanca aproximadamente a la mitad de sus lados ventrales. Ahora, incube los gusanos a 15 grados centígrados en la oscuridad durante unos siete días. El IPTG es sensible a la luz.
Cuando la progenie F1 alcance las etapas L3 y L4, sepárelos de los animales parentales más grandes y gruesos. En este punto, examine el F1 para el fenotipo de vulva que sobresale, lo que indica que el ARNi contra lin-53 ha tenido éxito. La actividad del ARNi también puede resultar en letalidad, que aumenta por encima de los 15 grados Celsius. Para activar G1 e inducir la conversión de células germinales a neuronas en la progenie F1, aplique un choque térmico a los gusanos durante 30 minutos a 37 grados Celsius en la oscuridad. Use una incubadora ventilada, ya que permite un choque térmico más eficiente.
Después del choque térmico, incube las placas a 25 grados centígrados durante la noche en la oscuridad. Es importante evitar inducir la sobreexpresión de Q1 por choque térmico antes de que los animales alcancen la etapa L3 media. Esto puede conducir a la expresión de la proteína Q1 en tejidos no dirigidos. Al día siguiente, configure una fuente de luz de fluorescencia y un filtro GFP para examinar a los animales en busca de fluorescencia derivada de transgenes en el área media del cuerpo.