Aislamiento de células inmunitarias de plexos coroideos de ratón

Coloque el cerebro de un ratón con el lado dorsal hacia arriba.

Bajo un microscopio, separe los hemisferios cerebrales. Retire la corteza y luego el hipocampo para exponer los ventrículos laterales y el tercer ventrículo.

Recoge dos plexos coroideos laterales. Estas son estructuras cerebrales ricas en células inmunes que recubren los ventrículos laterales como un largo velo.

Recoge el plexo coroides del tercer ventrículo, que es una estructura corta con una superficie granular.

Separe el cerebelo para exponer el cuarto ventrículo.

Recoge el plexo coroides del cuarto ventrículo, que es una estructura globular larga con una superficie granular.

Coloque todos los plexos coroideos en un tubo con solución salina tamponada para mantener la integridad del tejido.

Agregue una solución de enzimas digestivas e incube con agitación.

La enzima descompone la matriz extracelular y afloja las células.

Agregue un tampón adecuado para inactivar la enzima.

Centrifugar para asentar las células. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un tampón nuevo para su posterior análisis.

Para comenzar, coloque el cerebro diseccionado de un ratón negro C57 6 con la dorsal hacia arriba en una placa de Petri y coloque la placa debajo de los objetivos de las lupas binoculares. Mientras mantiene el cerebro en su lugar con fórceps, inserte los dos extremos de otro par de fórceps hacia abajo a través de la línea media entre los hemisferios.

Con las pinzas, tire de la corteza con el calloso y el hipocampo lejos del tabique, exponiendo el ventrículo lateral y una parte del tercer ventrículo. Identifique el plexo coroideo lateral como un velo largo que recubre el ventrículo lateral y se ensancha en ambos extremos. Luego, usando dos extremos de pinzas delgadas, recoja el plexo coroideo lateral. Tenga cuidado de recoger la parte posterior triangular oculta por el pliegue posterior del hipocampo.

A continuación, tire de la corteza con el cuerpo calloso y el hipocampo del hemisferio contralateral, lejos del tabique para exponer todo el tercer ventrículo y el ventrículo lateral opuesto. Con unas pinzas finas, recoger el tercer plexo coroides identificado como una estructura corta con un aspecto de superficie granular. Luego, recoja el otro plexo coroideo lateral.

A continuación, inserte los dos extremos de las pinzas entre el cerebelo y el mesencéfalo y separe el cerebelo de la protuberancia y la médula para exponer el cuarto ventrículo. Luego, identifique el cuarto plexo coroideo como una estructura globular larga con un aspecto de superficie granular que recubre el cuarto ventrículo desde el extremo lateral derecho hasta el extremo izquierdo entre el cerebelo y la médula. Con unas pinzas finas, recoge el cuarto plexo coroideo.

Después de incubar todos los plexos coroideos recolectados con colagenasa IV, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces para finalizar la disociación. Luego, llene el tubo a 1,5 mililitros con tampón MACS para detener la actividad de la colagenasa IV. A continuación, centrifuga las células y desecha el sobrenadante antes de lavarlas con 1,5 mililitros de tampón MACS. Después de agregar las perlas de compensación adecuadas y las soluciones de anticuerpos, incube las muestras en hielo durante 30 a 45 minutos, protegiéndolas de la exposición a la luz. Luego, llene los tubos con 1,5 mililitros de tampón MACS.