Obtención de un cultivo de células gliales mixtas a partir de un cerebro de ratón neonatal

Comience con un cerebro de ratón neonatal y transfiéralo a un tubo que contenga una solución de enzima proteolítica.

Las enzimas degradan la matriz extracelular del tejido e inician la disociación celular.

Lave repetidamente el tejido digerido con un medio de cultivo para eliminar las enzimas.

Utilice una pipeta de mayor diámetro para mover el tejido repetidamente a través de la pipeta para disociarlo en fragmentos más pequeños.

Luego, usando una pipeta de menor diámetro, continúe disociando los fragmentos, creando una suspensión celular.

Filtre esta suspensión para eliminar los grupos celulares y obtener una suspensión unicelular que contenga neuronas primarias y una población mixta de células gliales, incluidas la microglía y los astrocitos.

Sembrar las células en un matraz de cultivo que contenga un medio de crecimiento e incubar para promover su adherencia.

Con el tiempo, la ausencia de factores de crecimiento neuronal en los medios provoca la muerte neuronal.

Reemplace los medios gastados con medios nuevos. Las células gliales utilizan los nutrientes y proliferan, generando un cultivo glial mixto de astrocitos y microglía.

Transfiera el cerebro a un tubo de 50 mililitros que contenga 2 mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% e incube durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Lave el cerebro con medio de crecimiento fresco, agregando y quitando el medio. Después de completar los lavados, agregue 2 mililitros de medio de crecimiento por cerebro y homogeneice triturando el cerebro.

Cuando el tejido cerebral no se hace más pequeño, haga la transición a una pipeta con una abertura más pequeña. Al final de la titulación, cuando la suspensión esté transparente sin trozos visibles, pase la suspensión a través de un colador celular de 70 micras para crear un cultivo unicelular.

Luego, pipetee de 8 a 9 milímetros de medio de crecimiento en matraces T75, dos matraces por cerebro, y agregue 1 mililitro de homogeneizado cerebral a cada matraz. Cultive las células hasta el aislamiento el día 16.