Obtención de varias poblaciones de células neuronales a partir de un hipocampo de ratas

Tome fragmentos de hipocampo de rata perfundidos.

Incubar con papaína para digerir la matriz extracelular del tejido y aflojar las células, incluidas las neuronas, los astrocitos y la microglía.

Agregue DNasa y mezcle.

Disociar mecánicamente el tejido mediante pipetas de diámetros progresivamente decrecientes para obtener una suspensión unicelular. Incubar para que la DNasa degrade el ADN contaminante.

Pase la suspensión a través de un colador, eliminando los escombros.

Agregue tampón que contenga iones divalentes para detener la actividad enzimática.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante rico en enzimas.

Ahora, agregue perlas magnéticas tampón y antimielina. Incube para que las perlas se unan a los restos de mielina.

Después de la incubación, centrifugar y eliminar el sobrenadante.

Vuelva a suspender la mezcla en tampón y cárguela en una columna de separación magnética que contenga esferas ferromagnéticas colocadas en el campo magnético del clasificador magnético.

El campo magnético retiene los restos de mielina unidos a perlas magnéticas en la columna mientras pasan las células libres de mielina.

Lave la columna con tampón y recoja el flujo continuo que contiene neuronas, astrocitos y microglía.

Comience la disociación neural usando hojas de afeitar estériles para cortar cada muestra recolectada de tejidos cerebrales adultos en pequeños trozos de 30 a 400 miligramos en la tapa de una placa de cultivo de seis pocillos. A continuación, sumerja el tejido en 1 mililitro de HBSS sin calcio ni magnesio, y utilice una pipeta para transferir las muestras a tubos de centrífuga estériles de 2 mililitros.

Cuando se hayan recolectado todos los tejidos, centrifugar las muestras, aspirar los sobrenadantes e incubar las muestras durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados, invirtiendo el tubo varias veces cada cinco minutos para volver a suspender los trozos de tejido sedimentados.

Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de tubo mezclado con enzimas recién preparado a cada muestra e invierta suavemente los tubos. A continuación, utilizando una pipeta Pasteur etiquetada como 1, disociar cada muestra con 30 de trituración hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no generar burbujas. Incubar las muestras durante otros 15 minutos a 37 grados centígrados con inversión cada cinco minutos, seguido de la disociación de las muestras con la pipeta Pasteur número 2, como se acaba de demostrar.

A continuación, cambie a la pipeta número 3. Repetir la disociación e incubar las muestras durante 10 minutos más en el baño maría, con inversión cada cinco minutos. Al final de la incubación, filtre las suspensiones unicelulares a través de filtros celulares de 80 micras en tubos Falcon de 15 mililitros, lavando cada filtro con 10 mililitros de HBSS sin calcio ni magnesio para detener las reacciones enzimáticas. Cuando se haya filtrado la última muestra, gire los tubos hacia abajo y aspire los sobrenadantes.

Para agotar la mielina de las suspensiones celulares, vuelva a suspender completamente los gránulos en 400 microlitros de tampón de eliminación de mielina y agregue la cantidad adecuada de perlas de eliminación de mielina a cada tubo. Pipetea las soluciones hacia arriba y hacia abajo hasta que las células y las perlas estén bien mezcladas. Luego, incube la muestra a 4 grados centígrados durante 15 minutos. Después de la incubación, lave cada muestra en 5 mililitros de tampón de eliminación de mielina.

Mientras las celdas giran, coloque una columna para cada muestra en el campo magnético de un clasificador magnético y coloque un filtro limpio de 80 micras en la parte superior de cada columna. Enjuague cada filtro y columna con 1 mililitro de tampón de eliminación de mielina tres veces, recogiendo todo el flujo en un contenedor de desechos.

Después del enjuague final, coloque tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mililitros directamente debajo de cada columna para recoger el eluido. Luego, aspire el sobrenadante de las muestras y vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de tampón de eliminación de mielina.

Aplique inmediatamente las suspensiones celulares a las columnas, recogiendo las células en los tubos de abajo. Luego, enjuague cada filtro y columna 4 veces con 1 mililitro de tampón de eliminación de mielina por lavado. Después del último lavado, gire las células hacia abajo y aspire los sobrenadantes.