JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 2:10 min • July 8th, 2025
Tomar una suspensión de células obtenidas de gusanos transgénicos Caenorhabditis elegans en un medio de cultivo.
La suspensión contiene células de varios tejidos, incluidas las neuronas del sistema nervioso.
Los gusanos transgénicos fueron diseñados para expresar una proteína fluorescente conjugada a un transportador transmembrana vesicular. Este transportador, presente en las vesículas sinápticas que transportan el neurotransmisor acetilcolina, se encuentra en las neuronas colinérgicas de todo el cuerpo.
Centrifugar la suspensión celular y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en un medio de cultivo nuevo para la clasificación de células activadas por fluorescencia, o FACS.
Analice la suspensión de celdas mediante FACS. Las neuronas colinérgicas marcadas con fluorescencia emiten fluorescencia al exponerse a la luz de una longitud de onda adecuada, separándolas de otras células no marcadas.
Transfiera las neuronas aisladas a una placa de pocillos múltiples. Incube las células en una cámara humidificada para mantener el nivel de humedad.
Centrifugar las células de la suspensión celular aislada a 10.000 veces g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células granuladas en un medio suplementado con L-15 a una densidad celular de no más de 6 millones de células por mililitro para evitar sobrecargar el citómetro de flujo. Luego, clasifique las células por expresión positiva de GFP utilizando un citómetro de flujo capaz de clasificar muestras.
Las células GFP negativas se pueden utilizar como control para el análisis no específico del tipo de célula. Después de esto, coloque las células aisladas en los pocillos de una placa estéril de seis pocillos. Coloque el plato en un recipiente de plástico. Agregue una toallita húmeda o papel de seda suave para agregar humedad a las células e incubar a 20 grados centígrados.