JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 5:29 min • July 8th, 2025
Cosecha la médula espinal del ratón y córtala en fragmentos.
Transfiera los fragmentos a un tubo que contenga una enzima proteolítica y ADNasa. Vórtice e incube.
La enzima digiere la matriz extracelular del tejido, mientras que la ADNasa degrada el ADN libre contaminante.
Vuelva a agitar y pipetear repetidamente para completar la disociación del tejido, obteniendo una suspensión unicelular.
Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en una solución que contenga ADNasa, un inhibidor de la proteasa y un vórtice. El inhibidor neutraliza la enzima.
Coloque una capa de solución inhibidora nueva en la parte superior, centrifugue y retire el sobrenadante.
Vuelva a suspender las celdas en medios de gradiente de densidad, vórtice y luego centrifuge.
Las células se asientan en la parte inferior, mientras que los restos de mielina permanecen en la parte superior.
Deseche los escombros. Lave repetidamente con tampón, centrifugue y retire el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en los medios de crecimiento.
Coloque las celdas en placas. La superficie sin recubrimiento facilita la adhesión de las células gliales.
Retire el medio gastado y agregue medios nuevos para inducir la proliferación de células gliales, estableciendo un cultivo glial mixto.
Trabajando en una campana de cultivo de tejidos, transfiera cuatro médulas espinales de ratón a una placa de Petri de HBSS. Use tijeras y fórceps estériles para cortar cada una de las médulas espinales en pedazos pequeños. Luego, transfiera las piezas a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga una mezcla de enzimas de papaína ADNasa. Evite transferir HBSS a la mezcla de enzimas, ya que esto puede resultar en una disminución del rendimiento de la enzima.
Es crucial que las piezas de tejido estén bien digeridas para obtener una suspensión unicelular. Sin embargo, la digestión excesiva dará como resultado menos células viables. Cada laboratorio necesita realizar pruebas piloto para determinar el tiempo exacto de digestión en función de lo que funciona mejor para sus células.
A continuación, agite suavemente el tubo en forma de vórtice y luego incube a 37 grados Celsius durante una hora con agitación orbital a 150 rotaciones por minuto. Después de la incubación, agite el tubo en forma de vórtice y luego triture vigorosamente el tejido con una pipeta de 5 mililitros para promover una mayor disociación. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 300 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Durante la centrifugación, agregue 300 microlitros de solución inhibidora de ovomucoides de albúmina reconstituida a 2,7 mililitros de EBSS en un tubo estéril y mezcle bien. Luego, agregue 150 microlitros de solución de ADNasa. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en el inhibidor ovomucoide de albúmina recién preparado y la solución de ADNasa. Pozo de vórtice para romper el gránulo celular.
Luego, agregue 3 mililitros de solución inhibidora de ovomucoides de albúmina reconstituida sin ADNasa a la suspensión celular. Centrifugar las células a 70 veces g durante 6 minutos a temperatura ambiente. Después del centrifugado, retire el sobrenadante que contiene fragmentos de membrana y retenga el gránulo.
Para eliminar la mielina de las células disociadas de la médula espinal, primero, agregue 8 mililitros de medio de gradiente de densidad al 20% a temperatura ambiente en el tubo que contiene el gránulo celular y el vórtice suavemente. A continuación, centrifugar las células a 800 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin romperlas. Después de la centrifugación, aspire con cuidado la capa superior de desechos, que contiene principalmente mielina, y el sobrenadante que sale del gránulo.
Para eliminar cualquier gradiente de densidad restante, lave las células resuspendiendo el gránulo con 8 mililitros de cDMEM diluido con HBSS. Centrifugar las células a 400 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante y lave las células con cDMEM diluido como antes.
Después de quitar el sobrenadante, el gránulo se puede almacenar en hielo hasta sembrar las células. Una vez listo para el recubrimiento, vuelva a suspender las celdas en 14 mililitros de cDMEM suplementado con 2-mercaptoetanol y agregue 1 mililitro de la suspensión celular a cada pocillo en una placa de 12 pocillos.
Placas de pocillos adicionales que se pueden usar para determinar el número promedio de células por pocillo y el contenido microglial del cultivo. Una vez que las células hayan sido sembradas, incube las células a 35,9 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. Cambie el medio el día 1, que es el día después del emplatado.
Algunas células están unidas a la placa de cultivo, pero siguen siendo en su mayoría redondas. También hay muchas celdas flotantes y escombros significativos. Repita el cambio de medios tres o cuatro días después.