Diferenciación de progenitores óticos multipotentes inmortalizados en neuronas ganglionares espirales y evaluación de la diferenciación

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga cubreobjetos estériles recubiertos con un sustrato de cultivo celular.

Introducir progenitores óticos multipotentes inmortalizados, o iMOPs, en un medio de diferenciación neuronal.

Las iMOP son precursoras de varias células del oído interno, incluidas las neuronas ganglionares espirales, o SGN, que transmiten información auditiva al cerebro.

Incubar, permitiendo que las células se adhieran al sustrato. El medio induce la diferenciación de las iMOP en SGN.

Agregue un fijador para inducir la reticulación de proteínas, preservando la morfología celular, y una solución detergente para permeabilizar las membranas celulares.

Introduzca un reactivo de bloqueo para evitar el etiquetado no específico.

Agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos específicos para marcadores de diferenciación neuronal e incube, lo que permite que los anticuerpos marquen los SGN.

Lave para eliminar los anticuerpos no unidos y monte los cubreobjetos con un medio de montaje que contenga una tinción nuclear fluorescente.

Mediante microscopía de fluorescencia, detecte las señales de anticuerpos para confirmar la diferenciación de iMOP en SGN.

Primero, limpie los cubreobjetos de vidrio redondos colocándolos en una placa estéril de 100 milímetros y sumergiéndolos en etanol al 70%. Agite suavemente los cubreobjetos para asegurarse de que estén cubiertos y deje el plato a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, enjuague los cubreobjetos tres veces en 1x PBS estéril y luego una vez con agua estéril.

Luego, deje que los cubreobjetos se sequen exponiéndolos a la luz ultravioleta en una campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos. Para uso inmediato, coloque un cubreobjetos estéril en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y agite suavemente la placa para asegurarse de que todos los cubreobjetos queden planos. Luego, cubra los cubreobjetos agregando 0.25 mililitros de 1x PBS que contenga 10 microgramos por mililitro de poli-D-lisina a cada pocillo.

Después de que la placa se haya incubado durante una hora a 37 grados centígrados, retire la solución de poli-D-lisina y lave los pocillos tres veces con 1x PBS estéril. Una vez aspirado el líquido del último lavado, introducir 0,25 mililitros de 1x PBS que contenga 10 microgramos por mililitro de laminina en cada uno de los 24 pocillos. Después de incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados, aspire la solución de laminina. Luego, lave cada pocillo con 1 mililitro de 1x PBS tres veces, pero deje el PBS del último lavado en los pocillos hasta que las celdas estén listas para ser sembradas.

Para comenzar la diferenciación neuronal, cuente las células de las otosferas disociadas como se describió anteriormente y luego vuelva a suspenderlas en un medio de diferenciación neuronal precalentado. Proceda sembrando entre 1 y 1,5 x 10^{5 celdas} iMOP en cada pocillo de la placa que contiene los cubreobjetos recubiertos. Incube la placa a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%, reemplazando el medio de diferenciación neuronal cada dos días.

Después de siete días, aspire el medio y fije las células, que deben estar adheridas a los cubreobjetos, agregando formaldehído al 4% en cada pocillo y dejándolas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, retire el formaldehído y lave las células una vez en 1x PBS que contenga Triton X-100 al 0,1%. A continuación, retire el tampón de lavado y agregue un tampón de bloqueo que consiste en 1x PBS que contiene 10% de suero de cabra normal y 0.1% de Triton X-100 a cada pocillo.

Deje las células durante una hora a temperatura ambiente y luego retire el líquido y reemplácelo con un tampón de bloqueo que contenga la dilución adecuada de anticuerpos Cdkn1b o Tubb3. Después de una incubación nocturna a 4 grados Celsius, lave las células una vez con 1x PBS que contenga 1% de Triton X-100 y luego proceda con la inmunotinción como se describió anteriormente. Una vez completada la tinción, realice un lavado final agregando 1x PBS a los pocillos.

Para prepararlos para el análisis, retire los cubreobjetos a los que están unidas las células de tinción de la placa de 24 pocillos y colóquelos en un medio de montaje en un portaobjetos de vidrio. Después de dejar que el medio de montaje se seque durante la noche a 4 grados centígrados, adquiera imágenes de epifluorescencia como se describió anteriormente.