Cultivo e imagen ex vivo de cortes oculomotores de embriones de ratón transgénicos

Tome un ratón preñado transgénico, aísle quirúrgicamente el útero que contiene embriones y lávelo para eliminar la sangre residual.

Retire los embriones que contienen neuronas motoras marcadas con fluorescencia y transfiéralos a la tapa de una placa de pocillos múltiples.

Agregue agarosa fundida y enfríe la tapa para inducir la formación de gel, incrustando los embriones.

Bajo un microscopio de fluorescencia, alinee los núcleos oculomotores y los ojos en una línea y recorte la agarosa paralela a la línea.

Fije un embrión en una etapa de muestra y colóquelo en una cámara de vibratomo llena con un tampón de corte frío.

Usando el vibratomo, genere cortes que contengan los núcleos oculomotores y los ojos. Los núcleos forman los nervios oculomotores que controlan el movimiento ocular.

Transfiera las rodajas a insertos de cultivo dentro de una placa de pocillos múltiples que contenga un medio de cultivo e incube.

Usando un microscopio de fluorescencia, obtenga imágenes a intervalos regulares para observar las neuronas oculomotoras marcadas con fluorescencia que extienden los axones para llegar a los ojos.

Antes de comenzar el procedimiento, primero, confirme el embarazo mediante ultrasonido en el día embrionario 10.5 de un apareamiento cronometrado. Recolecte los embriones, rocíe el abdomen de la rata preñada con etanol al 70% y use tijeras para abrir la cavidad abdominal y extraer el útero. Lave el útero en una placa de Petri de HBSS helado antes de colocar el órgano en una segunda placa de Petri de HBSS fresco helado.

Bajo un microscopio de disección, retire los embriones del cuerno uterino y sus sacos amnióticos individuales, colocando cada embrión en la parte inferior de la tapa de una placa de 12 pocillos en hielo a medida que se recolectan. Use papel de filtro para eliminar cualquier líquido que rodee cada embrión sin tocar los embriones en sí, y sumerja los embriones en agarosa líquida de bajo punto de fusión al 4%.

Coloque la tapa del plato sobre hielo para solidificar la agarosa. Cuando la agarosa esté endurecida, voltee los embriones y cubra el otro lado de cada muestra con agarosa adicional. Cuando el segundo volumen de agarosa se haya solidificado, use un microscopio de disección de fluorescencia para recortar la agarosa alrededor de cada embrión para que cada embrión se oriente correctamente en la etapa de vibratomo.

Los núcleos oculomotores y las excrecencias tempranas de los axones deben ser fluorescentes. Alinee cada embrión de modo que el núcleo, los axones salientes y el ojo formen una línea, y use una hoja de afeitar para recortar la agarosa paralela a esta línea. A continuación, llene una cámara de vibratomo con tampón de rodajas heladas y pegue el primer embrión a la etapa de vibratomo para que la hoja quede paralela al núcleo oculomotor y los ojos.

Cuando el superpegamento esté seco, sumerja la etapa de vibratomo para que el embrión quede orientado hacia afuera de la cuchilla y use una nueva cuchilla de vibratone para obtener cortes de 400 a 450 micrómetros. Utilice una pipeta de transferencia estéril para transferir cada rebanada a un tampón de corte en frío a medida que se adquiere, y utilice el microscopio de disección de fluorescencia para seleccionar la rebanada que contiene los núcleos oculomotores y los ojos.

Con una pipeta de transferencia estéril, transfiera la rebanada a un cultivo celular, insértela en una placa de 6 pocillos que contenga 1,5 mililitros de medio de cultivo por pocillo y coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius. Retire la agarosa residual de la etapa inferior y pegue con pegamento el siguiente embrión en la etapa, continuando recolectando cortes hasta que todos los embriones hayan sido seccionados y plateados, y la imagen de los cortes cada 30 minutos mediante contraste de fase y microscopía de fluorescencia hasta por 72 horas.