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Neurociencia
0 vistas • 3:15 min • July 8th, 2025
Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga células madre pluripotentes inducidas por humanos, o iPSC, en un medio con un inhibidor de la Rho-quinasa, que promueve la supervivencia celular.
Reemplace el medio con un medio esencial que contenga nutrientes y factores de crecimiento.
Incubar para permitir la proliferación y diferenciación de iPSC en células precursoras.
Reemplace este medio con un medio de diferenciación complementado con factores de crecimiento de fibroblastos y ácido retinoico, luego incube.
Los factores de crecimiento facilitan la diferenciación de las células precursoras en células endoteliales microvasculares, mientras que el ácido retinoico promueve la síntesis de proteínas de unión estrecha.
Lave y trate las células con una solución enzimática de EDTA para separarlas, creando una suspensión unicelular.
Centrifugar para recolectar las células y eliminar el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender las células en un medio de diferenciación fresco.
Siembre esta suspensión celular en una placa de pocillos múltiples recubierta con colágeno y proteínas de adhesión.
Incubar para permitir la adhesión celular, formando uniones estrechas entre las células, que se asemejan a las células endoteliales microvasculares del cerebro.
Para inducir la diferenciación de BMEC de las iPSC humanas, lave el cultivo de iPSC confluente con DPBS una vez antes de incubar las células con el volumen adecuado de EDTA enzimático durante aproximadamente cinco minutos a 37 grados Celsius.
Cuando se haya obtenido una suspensión unicelular, recolecte las células por centrifugación y vuelva a suspender el sedimento en un volumen apropiado de medio de células madre, complementado con 10 inhibidores micromolares de ROCK para el recuento.
Diluya las células a una concentración de 1,56 por 10 a la cuarta célula por centímetro cúbico, y siembre 2 mililitros de células en pocillos individuales de un fondo plano de 6 pocillos. Después de 24 horas en la incubadora de cultivos celulares, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con medio E6 y regrese la placa a la incubadora durante cuatro días más.
Para purificar los BMEC derivados de iPSC, cubra las placas de subcultivo con el volumen apropiado de una solución de colágeno IV y fibronectina recién preparada por pocillo, e incube las placas durante un mínimo de dos horas a 37 grados Celsius.
En el día 6 de diferenciación, recolecte las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en el volumen apropiado de medio fresco libre de suero endotelial humano suplementado con B27, factor de crecimiento de fibroblastos básico y ácido retinoico. Coloque las células en cada pocillo de una placa de fondo plano de 24 pocillos recubierta de colágeno y fibronectina.