Aislamiento y cultivo de neuronas embrionarias de pollo en una matriz de electrodos múltiples

Tome un huevo de gallina fertilizado que contenga un embrión en etapa temprana.

Esterilice la cáscara y ábrala con cuidado.

Retire el embrión. Diseccionar y transferir la cabeza a una placa de cultivo que contenga un tampón. Retire el globo ocular.

Haga una incisión y retire las capas de la piel, exponiendo el prosencéfalo y el mesencéfalo.

Retire la capa membranosa interna y los vasos sanguíneos. Diseccionar y transferir el prosencéfalo a una placa de cultivo con un tampón.

Corta el tejido en fragmentos más pequeños y transfiérelos a un tubo cónico. Una vez que los fragmentos se asienten, retire el búfer.

Agregue una solución de enzimas proteolíticas. Incubar para digerir la matriz extracelular del tejido y aflojar las neuronas.

Retire los medios ricos en enzimas, lave con medios neurobasales, eliminando las enzimas restantes.

Agregue medios neurobasales. Disociar mecánicamente el tejido para obtener una suspensión neuronal.

Siembra estas neuronas en un sistema de matriz de electrodos múltiples recubierto con una matriz extracelular. Agregue medios neurobasales e incube.

Las neuronas se unen y extienden proyecciones, formando una red neuronal.

El día de la siembra de neuronas, retire un vial de matriz extracelular del congelador a -20 grados centígrados. Rocíe con etanol al 70% y colóquelo en hielo. Asegúrese de descongelar la matriz extracelular en hielo. No descongele a temperatura ambiente, ya que la ECM polimeriza por encima de 0 grados centígrados.

Trabaje en la campana BSL-2 para diluir la matriz extracelular al 25% agregando 300 microlitros de medio neurobasal frío a la alícuota de 100 microlitros. Luego, use una pipeta P200 para agregar 100 microlitros de solución de matriz extracelular al 25% al centro de la matriz de electrodos múltiples, teniendo cuidado de no tocar los electrodos. Retire inmediatamente el ECM, dejando una película delgada en la superficie.

Cubra la matriz de electrodos múltiples y colóquela en la incubadora de cultivo de tejidos hasta que esté lista para colocar las neuronas. Comience el aislamiento de las neuronas de los pollitos esterilizando la cáscara exterior de un huevo E7 con etanol al 70%. Es importante mantener condiciones estériles a partir de este momento. Asegúrese de que todos los instrumentos estén esterilizados con etanol al 70% y que las soluciones sean estériles. Es útil usar una campana de disección, pero no es absolutamente necesario para las disecciones, si se realiza rápidamente.

Luego, después de recuperar y decapitar el embrión, corte alrededor de los ojos y retire los globos oculares. A continuación, use pinzas finas Dumont número 5 y tijeras de resorte para hacer una incisión en el lado ventral y retire las capas externas de piel para exponer el cerebro anterior y el tectum óptico. Pele y retire la membrana pelable con cuidado.

Transfiera el prosencéfalo a otra placa de Petri que contenga HBS y córtelo en trozos pequeños de aproximadamente 2 milímetros con unas tijeras de resorte. Use una pipeta de transferencia estéril para transferir los trozos de prosencéfalo a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Después de que los pedazos de prosencéfalo se hundan en el fondo del tubo de centrífuga, retire la mayor cantidad posible de HBS.

A continuación, agregue 1 mililitro de tripsina-EDTA al 0,5% precalentado e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar con cuidado la tripsina sin alterar los trozos de tejido. Agregue 1 mililitro de medio neurobasal y deje que los trozos de tejido se hundan hasta el fondo. Después de retirar el medio y repetir el lavado, añadir 2 mililitros de medio neurobasal y triturar suavemente hasta que no se vean más trozos de tejido.

Diluya las células resuspendidas 1 a 10 con medio neurobasal y cuente las células viables con colorante azul de tripano y un hemocitómetro. Después del recuento, coloque las celdas asociadas en matrices de electrodos multielectrodos recubiertas de ECM a una densidad de 2.200 celdas por milímetro cuadrado.