La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía
14 de junio de 2011
Una técnica de la litografía plasma versátil se ha desarrollado para generar patrones estables de superficie para guiar la unión celular. Esta técnica puede ser aplicada para crear redes de células, incluyendo las que imitan los tejidos naturales y se ha utilizado para el estudio de varios tipos, distintos de células.
El objetivo general del siguiente experimento es crear microentornos celulares para estudiar preguntas biológicas relacionadas con los comportamientos individuales y colectivos de las células que ocurren en dimensiones a escala micro y nanométrica. Esto se logra primero diseñando plantillas que finalmente guiarán la colocación de las células. A continuación, estos diseños se traducen en superficies patrón mediante litografía por fotolitografía, lo que permite la creación de moldes de blindaje de plasma mediante litografía suave.
Finalmente, estos moldes de blindaje se disponen en forma de trípode en una placa de Petri para permitir la exposición selectiva de las superficies subyacentes al plasma, lo que dejará un patrón químico sensible a las células en las áreas bajo cada molde. Los resultados pueden mostrar cómo el comportamiento de una célula depende de su microentorno y de su interacción con células vecinas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los efectos de los microentornos en el comportamiento celular, como, por ejemplo, ¿cómo afectan las interacciones entre grupos de células a fenómenos de orden superior?
¿Y cómo afectan las señales subcelulares a escala nanométrica funciones como la migración y la diferenciación celular? Primero, utilice pegamento epoxi para fijar una lámina con patrón a un conjunto de láminas en blanco. A continuación, cree un recipiente de papel de aluminio ligeramente más grande que el conjunto de láminas, y lo suficientemente grande como para contener 30 gramos de poli(dimetilsiloxano) o PDMS.
Coloque la pila de portaobjetos en el recipiente y luego vierta PDMS sobre la pila de portaobjetos para crear un molde inicial. A continuación, desgasifique el PDMS colocando el recipiente dentro de una cámara de vacío. Rompa las burbujas presentes en el PDMS retirando y colocando rápidamente un dedo sobre el tubo de la válvula de entrada varias veces para permitir brevemente que el aire fluya hacia la cámara.
La válvula permanece cerrada durante cinco minutos de desgasificación ininterrumpida. A continuación, deje que el PDMS se cure en la cabina de flujo limpio a temperatura ambiente durante uno o dos días. Una vez curado, el PDMS se desprende del patrón maestro, formando un molde.
A continuación, vierta una capa delgada de seis gramos de epoxi de dos componentes que acaba de mezclarse durante un minuto en el molde maestro. Desgasifique inmediatamente el epoxi utilizando varios ciclos de eliminación de burbujas antes de que el epoxi se endurezca. Después de dejar reposar el epoxi desgasificado sin perturbar durante una hora, este se habrá curado parcialmente.
Agregue más epoxi al molde sin desgasificar para producir una estructura más gruesa que será más fácil de manipular en pasos posteriores. Luego, permita que el epoxi se cure durante uno o dos días. Una vez que el molde de epoxi esté curado, retire el epoxi del molde maestro de PDMS y luego envuelva cinta alrededor del molde de epoxi para formar un recipiente.
Un molde funcional puede entonces crearse vertiendo PDMS sobre el molde de epoxi, desgasificando el PDMS y curando el nuevo molde durante uno o dos días. Después de que el molde funcional se haya curado, retire el molde del epoxi y almacene ambos moldes dentro de placas de Petri en un recipiente plástico sellado dentro de la cabina de flujo laminar para mantener la limpieza. Para preparar un molde para el estampado de superficies, corte secciones pequeñas del molde funcional con una cuchilla de afeitar y coloque las secciones en una placa de Petri.
Las ubicaciones de estas secciones del molde se etiquetan en la parte posterior de la placa de Petri con un marcador permanente, dibujando un contorno alrededor de donde se sitúan las secciones del molde para formar un trípode a partir de las secciones y esperar al trípode para asegurar un contacto conformal entre el molde funcional y la superficie de la placa de Petri. Observar la parte inferior de la placa para confirmar una buena colocación, evidenciada por la presencia de canales que pueden verse a simple vista o con una lupa pequeña. Colocar el conjunto en una cámara de plasma.
Inicie el tratamiento con plasma después del tratamiento con plasma. Retire el molde y la disposición del peso y coloque la placa de Petri dentro de una cabina de seguridad biológica bajo luz ultravioleta durante 10 minutos para esterilización. Almacene la placa allí hasta que se siembre con células.
Diluya las células experimentales de elección en su medio de cultivo estándar para alcanzar la confluencia deseada. Cuando se coloquen sobre la superficie del plato de Petri patroneado, vierta tres mililitros de la solución celular en el plato de Petri. Incube el plato de Petri patroneado a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono, 100 % de humedad durante varias horas hasta varios días para permitir que las células se ensamblen sobre el patrón creado por la célula de plasma.
El patrón se verifica mediante microscopía de contraste de fase. Al cultivar células de neuroblastoma, añada 10 micromoles de ácido retinoico diariamente hasta observar la diferenciación celular hacia un estado similar al de una neurona. Reemplace el medio de cultivo celular estándar cada tres o cuatro días.
Un resultado típico de la implementación de la técnica de litografía por plasma es la formación de un patrón de células que se asemeja a alguna estructura arbitraria o natural. Un ejemplo de esto puede observarse en esta figura, con neuronas que han sido diferenciadas con ácido retinoico sobre un patrón de líneas. Y aquí en esta figura, donde se han creado líneas y redes de neuronas. También pueden utilizarse tipos celulares distintos de las neuronas, como se muestra en las siguientes dos figuras; esta figura muestra células endoteliales de vena umbilical humana, y esta figura muestra células musculares esqueléticas C2C12 formando cuadrículas, como se observa aquí.
Los materiales como la polilisina también pueden ser configurados para facilitar la adhesión de ciertos tipos celulares y para otros usos. Tras seguir este procedimiento, se puede incorporar entradas adicionales, como microfluídica, sondas celulares o manipulación genética de proteínas específicas, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como: ¿cómo afectan las combinaciones de estímulos al comportamiento celular individual y de orden superior?
Resumen
Se ha desarrollado una técnica versátil de litografía por plasma para crear patrones superficiales estables que dirigen la adhesión celular. Este método permite la formación de redes celulares que imitan tejidos naturales y facilita el estudio de diversos tipos celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Neurociencia
- Biomateriales
Antecedentes
- Comprender el comportamiento celular a dimensiones micro y nanométricas es fundamental para la investigación biológica.
- Los microentornos celulares influyen significativamente en el comportamiento individual y colectivo de las células.
- La litografía por plasma proporciona un método para crear entornos controlados para estudiar estos comportamientos.
- Las técnicas anteriores carecían de versatilidad en el trazado de patrones para diversos tipos celulares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para crear microentornos celulares que dirijan la colocación de las células.
- Investigar cómo los microentornos afectan el comportamiento y las interacciones celulares.
- Explorar las implicaciones de las señales a escala nanométrica en funciones celulares como la migración y la diferenciación.
Métodos Utilizados
- Diseñar plantillas para la colocación de células.
- Utilizar la fotolitografía para crear moldes de blindaje de plasma.
- Aplicar tratamiento con plasma para generar patrones químicos en superficies.
- Siembra de células en superficies con patrón y observación de su comportamiento.
Resultados principales
- Formación exitosa de patrones celulares que se asemejan a estructuras naturales.
- Demostración de la diferenciación de células de neuroblastoma hacia estados similares a neuronas.
- Observación de interacciones entre diferentes tipos celulares sobre superficies con patrones.
- Puso de relieve el papel de los microentornos en la influencia del comportamiento celular.
Conclusiones
- La técnica de litografía por plasma es eficaz para estudiar el comportamiento celular en entornos controlados.
- Este método puede adaptarse a diversos tipos celulares y preguntas de investigación.
- Estudios futuros pueden incorporar técnicas adicionales para explorar más a fondo las interacciones celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El patrón superficial mediante litografía de plasma permite la ingeniería precisa de microentornos celulares, favoreciendo estudios de alta resolución sobre el comportamiento y la interacción celular. Esta capacidad es fundamental para reducir los riesgos en hipótesis iniciales de descubrimiento y para avanzar en modelos predictivos de formación de tejidos y señalización celular. La estabilidad del método y su compatibilidad con diversos tipos celulares lo posicionan como una plataforma reutilizable para la investigación traslacional y el desarrollo de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación sistemática de las respuestas celulares frente a señales definidas del microentorno.
- Sirve para reducir riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de variables como la migración, la adhesión y la diferenciación.
- Facilita la validación funcional de dianas mediante la formación controlada de redes celulares.
- Mejora la confianza predictiva en el descubrimiento basado en vías y fenotipos.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona sustratos patrones estandarizados y reproducibles para ensayos cuantitativos basados en células.
- Permite la preparación a escala de superficies listas para ensayos, útiles para la selección de compuestos.
- Facilita la evaluación robusta del comportamiento celular bajo restricciones espaciales definidas.
- Permite la reutilización de la plataforma en múltiples tipos celulares y condiciones experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea redes celulares in vitro con arquitecturas de tejidos relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Facilita estudios a largo plazo de la diferenciación, adaptación y señalización entre células.
- Permite el avance de modelos preclínicos con ajuste de riesgos mediante la manipulación específica de los entornos celulares.
- Mejora el descubrimiento de biomarcadores mediante la observación controlada de las interacciones celulares.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de litografía por plasma integra desde el descubrimiento inicial hasta el desarrollo de ensayos y la investigación preclínica, permitiendo pruebas de hipótesis y validación de modelos sin interrupciones.
- Biología del Descubrimiento: Apoya estudios basados en hipótesis sobre el comportamiento celular y la formación de redes bajo patrones químicos definidos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para comparar las respuestas celulares frente a variables experimentales.
- Análisis: Ofrece lecturas de alto contenido para medir parámetros de migración, adhesión y diferenciación.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos mediante la imitación de estructuras tisulares nativas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estable y biocompatible, adaptable a múltiples programas de I+D y tipos celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios basados en células.
- Valor operativo: Proporciona sustratos patrones estandarizados, escalables y reproducibles para diversos flujos de trabajo.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción y un progreso eficiente en el uso del capital dentro de la cartera.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos de descubrimiento y preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en química de superficies, fotolitografía y técnicas de cultivo celular.
- Necesita acceso a cámaras de plasma, campanas de flujo laminar y infraestructura de microscopía.
- Exige estandarización entre equipos para lograr reproducibilidad en experimentos y sitios diferentes.
- Adaptable a diversos sustratos poliméricos y compatible con múltiples tipos celulares.
- La estabilidad del patrón permite estudios a largo plazo, aunque puede requerir optimización para aplicaciones específicas.
