Name: La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende la técnica de litografía de plasma para crear microambientes celulares que guían la colocación y comportamiento de células. Este método permite estudiar interacciones celulares y diferenciación en biomateriales.

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<p class="jove_content"&gt; Damos las gracias a DD Zhang para el debate profundo y brindar generosamente reactivos. MJ es apoyado por el NIH Cardio Training Grant, el Fondo de Arizona Technology Research Initiative, y premia los logros científicos de la universidad. Este trabajo es apoyado por el Premio a la Innovación Nuevo Director del NIH (1DP2OD007161-01), la National Science Foundation (0.855.890), y la Fundación James S. McDonnell.</p

1. La creación de moldes para modelar <ol><li> Diseño conceptual de los patrones. Patrones se crean que sirven para formar redes de telefonía, póngase en contacto con el control de células, aislar las células, imitar las estructuras naturales, o de lo contrario guía de adhesión celular y la colocación. </li><li> Asistido por ordenador o de creación de diseños CAD basada del patrón y la creación de fotomáscaras. El patrón deseado se ha diseñado en el software de CAD, como AutoCAD, y se envía a una empresa externa para la producción de una fotomáscara. </li><li> Fotolitografía para producir el patrón principal. Portaobjetos de vidrio siguen el modelo, ya sea con un resultado positivo delgada resistencia o negativa de grosor resisten dependiendo del tamaño de la estructura se está creando. Portaobjetos de vidrio se utilizan para sus beneficios de ser de bajo costo, más fuerte que las obleas de silicio y que no produce polvo tanto cuando se rompen. Por otra parte, otras estructuras convenientes tales como redes de difracción se puede utilizar como el modelo maestro. </li><li> La diapositiva patrón se une a un montón de diapositivas que no han sido modelados. Todos los pasos se llevan a cabo dentro de una campana de flujo limpia para minimizar el polvo. </li><li> Creación de moldes principales. Un recipiente con un poco más grande que la pila de láminas de papel de aluminio se ha creado para celebrar los 30 g de polidimetilsiloxano (PDMS), que se vierte sobre la superficie photolithographically patrón para crear un molde inicial. El PDMS se desgasifica y se dejó curar durante uno o dos días. </li><li> Una vez curado el PDMS se despega del modelo maestro y forma un molde para el siguiente paso. </li><li> 6 g de epoxi parte 2 (# 14310 Devcon (6 g) se mezcla durante 1 minuto y luego se vierte en el molde maestro, se desgasifica y se dejó curar. Desgasificación la resina se debe hacer rápidamente (&lt;8 min) con muchas burbujas romper los ciclos y con sólo una fina capa antes de que los conjuntos de epoxy y la eliminación de burbujas se convierte en imposible de eliminar las burbujas. El G-6 utilizados produce una fina capa que facilita la eliminación rápida de burbujas. </li><li> Después de una hora, el epoxi parte 2 será parcialmente curado epoxi y más se pueden añadir en la parte superior sin desgasificación para producir una estructura más gruesa que es easer de manejar en los pasos posteriores. El epoxi se deja curar durante uno o dos días. </li><li> Una vez curado, la resina se extrae del molde maestro PDMS y la cinta se envuelve alrededor del molde de epoxy para formar un recipiente. Un molde de trabajo, se crea mediante el vertido de PDMS sobre el molde de epoxy, desgasificación del PDMS, y la curación de uno o dos días. </li><li> Una vez curado, el molde de trabajo se despega de la resina y se almacena para mantener la limpieza. </li></ol> 2. Los patrones de las superficies de los moldes para la orientación de células <ol><li> Pequeñas secciones del molde de trabajo se cortan y se coloca sobre una placa de Petri de poliestireno. La ubicación de estas secciones del molde están etiquetados. </li><li> Un trípode está formado por las secciones pequeñas y ponderados para asegurar el contacto entre el molde de conformación de trabajo y la superficie de la placa de Petri. La buena ubicación se puede observar al mirar en el fondo del plato. </li><li> El conjunto se coloca en la cámara de plasma. Tratamiento con plasma se ha iniciado y continuado a 150 Pa a 29,6 W (potencia máxima) durante 10 minutos con aire de plasma. </li><li> Después del tratamiento de plasma, el molde y acusación de peso se eliminan. </li><li> La placa de Petri se coloca bajo luz ultravioleta durante 10 minutos de la esterilización en el interior del gabinete de bioseguridad y se almacena allí hasta sembrada con células. </li></ol> 3. La siembra de las superficies con las células <ol><li> Células SH-SY5Y CRL-2266 neuroblastoma humano o de otro tipo se cultivan a través de protocolos estándar para el tipo de célula. </li><li> La confluencia de la SH-SY5Y CRL-2266 células de neuroblastoma humano se mide visualmente antes de la siembra en la superficie modelada. </li><li> División celular estándar se lleva a cabo para eliminar las células de la superficie de su placa de Petri. </li><li> Las células, flotando, una vez libre, se siembran en la superficie de la placa de Petri con dibujos después de ser diluido para lograr la confluencia deseada cuando se coloca sobre la superficie modelada. </li><li> Las células se asientan y se adhieren a la superficie. </li><li> El plato Petri patrón se incuba durante varias horas a varios días, mientras que las células de montar en el modelo creado por el plasma. </li><li> Cuando el cultivo de las células del neuroblastoma, el ácido retinoico (10 M) se añaden a diario con el fin de inducir la diferenciación de las células en un estado de tipo neuronas. La adición del ácido retinoico se realiza en la oscuridad. </li><li> El ácido retinoico es por día durante varios días, después de que la diferenciación se podrán observar. </li><li> Los medios de comunicación se sustituye cada 3-4 días. </li></ol> 4. Observación y Análisis <ol><li> Imágenes periódicas de las células vivas o videos se toman con el fin de observar el comportamiento de la célula a través del tiempo. Para las imágenes en vivo, las células se colocan en un microscopio de fase superior incubadora que mantiene las células a 37 ° C CO, 100% de humedad y 5% 2. Las células también pueden ser fijados y teñidos para su observación en la fluorescencia </li><li las im o videos de c que han sido capturados son importados a un sistema an y mediciones se llevan cabo entre la tasa crecimiento tama celda velocidad migraci diferenciaci alineaci localizaci prote espec otros.></ol> 5. Los resultados representativos: Un resultado típico de la aplicación de la técnica de la litografía de plasma es la formación de un patrón de células que se asemeja a una estructura arbitraria o natural. Esto se ve en la Figura 1a-b, donde las líneas y redes de neuronas se han creado. Otros tipos de células se pueden utilizar, así como se ve en la figura 1c-d, lo que demuestra Humanos de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) y C2C12 células del músculo esquelético que forman las redes. Materiales tales como poli-l-lisina también puede ser modelada, la figura 1e para facilitar la fijación de ciertos tipos de células y para otros usos. En el caso de las neuronas se muestra, lo que se crean redes de células que tienen conexiones entre ellas. Esto reproduce lo que ocurre naturalmente en el cerebro donde las neuronas tienen conexiones discretas entre las células vecinas que influye en el funcionamiento del cerebro. Con la creación de una estructura en el laboratorio, el número, localización, frecuencia y otros factores de las conexiones puede ser controlado de manera sistemática. El resultado de estas comparecencias se puede medir visualmente y aportes adicionales tales como la química o la estimulación eléctrica se puede implementar para investigar el comportamiento de la red. Un resultado negativo sería un patrón de maleza o incompleta, o una muestra contaminada. Un patrón incompleto o agrandamiento de que el resultado de la siembra del sustrato con células muy pocos o demasiados que no proporcionaría el modelo con una cantidad ideal de las células. Además, si el patrón no está diseñado correctamente (por ejemplo, las líneas demasiado estrecha), las células no serán capaces de unir y crecer con éxito en él. En el caso de una muestra contaminada, la limpieza adecuada no se han mantenido durante uno de los pasos, aunque esto es raro cuando se sigue el protocolo adecuado de cultivo celular, debido al hecho de que el patrón de plasma también esteriliza el sustrato. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Patrones de células y proteínas.

<ol><li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li>
<li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li>
<li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li>
<li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+%28%CE%BCPIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li>
<li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li>
<li>Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma%3A+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li>
<li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrobel%2C+M+%22Plasma+surface+modification+of+polymers%3A+Relevance+to+adhesion%22">Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion</a>. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates%2C+Lengths%2C+and+Orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li>
<li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li>
<li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Coatings+Technology%22%5BJournal%5D)">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li>
<li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-treated+polystyrene+surfaces%3A+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li>
<li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li>
</ol>

El método de investigación de células que aquí se presenta permite la creación de patrones complejos de redes multicelulares que imitan las estructuras biológicas, así como proporciona un método para producir estímulos que son subcelular en la naturaleza que a su vez facilita la investigación de los comportamiento de las células agrupadas y las respuestas de células individuales a factores ambientales. El uso de este método es simple, pero fuerte, ya que puede realizarse rápidamente con equipos de bajo costo en el mismo laboratorio como el cultivo celular. También es muy sensible a la célula, permite una fácil observación de la conducta resultante y es, por naturaleza estable durante largos períodos, lo que permite la investigación de comportamiento a largo plazo de células. Es, además, permite una amplia gama de experimentos a realizar, ya que es compatible con muchos tipos de células y puede crear patrones arbitrarios. La estabilidad a largo plazo de la técnica deriva del hecho de que la funcionalización superficial impartida por el plasma es parte de la superficie y no es una capa o una capa de otros que pueden ser eliminados o degradados. Si se mantiene bajo agua, este tipo de modificación puede conservar su capacidad de orientación para celulares meses. La parte más crítica de la experiencia necesaria para garantizar resultados significativos es el de crear el modelo maestro que en última instancia será utilizado para la orientación de la célula. Si este patrón no está bien diseñado, las células no se ajustará adecuadamente a la estructura y no puede producir un comportamiento útil. Parámetros como el ancho de línea, el espacio de patrones, y otros pueden influir mucho en la compatibilidad de células con un patrón determinado, y por lo general una serie de parámetros como pueden ser creados en la fotomáscara inicial para detectar el diseño más apropiado. Otros parámetros importantes relacionados con la ejecución del patrón incluyen la creación del molde, el mantenimiento de un ambiente libre de polvo, la siembra de células y la esterilidad general de cultivo de células. La creación del molde se puede efectuar por los pasos sucesivos traslados que se llevan a cabo para permitir repetir PDMS arrojando un molde de epoxi. El molde de epoxy se crea debido a que no se degradará de la misma manera como resistir el moho con estructuras pequeñas, de alta relación de aspecto en fundición repetida. Si el moldeo por transferencia se hace correctamente, las dimensiones y el rendimiento no se verá afectada, pero si se hace incorrectamente, como por el mal de desgasificación, la curación incompleta, o calor excesivo, las burbujas, la aspereza y la deformación de un patrón puede ocurrir que afecta el resultado final. En relación con el mantenimiento de un ambiente libre de polvo, el moho se debe mantener lo más limpio posible, ya que el polvo puede interferir con el contacto adecuado entre el molde de trabajo PDMS y la superficie y por lo tanto adecuada protección de plasma y los patrones químicos. La densidad de siembra de las células también deben ser optimizados para asegurar que ni las células de muy pocos o demasiados habitan en el área de diseño y la esterilidad se debe mantener para evitar la contaminación bacteriana y otras de las células que se utiliza. La técnica también se pueden incorporar otros elementos como la microfluídica, microelectrodos, sondas y mecánica. Esto ofrece estímulos adicionales a las células con el fin de reproducir mejor los distintos estados fisiológicos durante la experimentación y el trabajo futuro se centra en estudiar los efectos de estas combinaciones

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Limpiador de plasma y cámara de vacío </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescencia invertido y el microscopio de contraste de fase </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio etapa superior incubadora </td><td> AmScope </td><td> Modelo TCS-100 </td><td> Modificado para incluir un recinto que proporciona un ambiente adecuado </td></tr><tr><td> Placa de Petri de poliestireno </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polidimetilsiloxano (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epoxy </td><td> Devcon </td><td> 2 ton claro epoxi # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Medios de cultivo celular </td><td> Varios </td><td></td><td> Los medios de comunicación sigue las fórmulas habituales para el tipo de células </td></tr><tr><td> El ácido retinoico </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

la litografía de plasma superficial patrones de creación de redes de telefonía

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Manipulación sistemática de un microambiente celular con una resolución de la micro y nanoescala es a menudo necesaria para descifrar varios fenómenos celulares y moleculares. Para cumplir con este requisito, hemos desarrollado una técnica de la litografía de plasma para manipular el microambiente celular mediante la creación de una superficie modelada con tamaños que van desde 100 nm a milímetros. El objetivo de esta técnica es ser capaz de estudiar, de forma controlada, el comportamiento de las células individuales, así como grupos de células y sus interacciones. Este método de litografía de plasma se basa en la modificación selectiva de la química de la superficie de un sustrato por medio de proteger el contacto del plasma de baja temperatura con un molde físico. Esta protección selectiva deja un patrón químico que puede guiar a la adhesión celular y el movimiento. Este patrón o plantilla de la superficie, se puede utilizar para crear redes de células, cuya estructura puede imitar a la que se encuentra en la naturaleza y produce un ambiente controlable para las investigaciones experimentales. La técnica es muy adecuada para el estudio de fenómeno biológico que produce patrones estables en la superficie transparente de sustratos poliméricos en forma biocompatible. Los patrones superficiales durar semanas o meses y puede guiar la interacción con las células de largos periodos de tiempo que facilita el estudio a largo plazo de los procesos celulares, tales como la diferenciación y la adaptación. La modificación a la superficie es principalmente de naturaleza química y por lo tanto no introduce interferencia topográficos o física para la interpretación de los resultados. Asimismo, no se recurra a ninguno de sustancias duras o tóxicas para alcanzar los patrones y es compatible para el cultivo de tejidos. Además, puede aplicarse para modificar los diferentes tipos de sustratos poliméricos, que debido a la capacidad de sintonizar sus propiedades son ideales para y se utilizan ampliamente en aplicaciones biológicas. La resolución a alcanzar también es beneficioso, como el aislamiento de procesos específicos como la migración, adhesión o unión permite observaciones discretas, claro en la única a nivel multicelular. Este método ha sido empleado para formar redes de tipos de células diferentes para las investigaciones relacionadas con la migración, la señalización, la formación de tejido, y el comportamiento y las interacciones de las neuronas instruido de cargos en una red.

Una técnica de la litografía plasma versátil se ha desarrollado para generar patrones estables de superficie para guiar la unión celular. Esta técnica puede ser aplicada para crear redes de células, incluyendo las que imitan los tejidos naturales y se ha utilizado para el estudio de varios tipos, distintos de células.

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

La manipulación sistemática de un microentorno celular con resolución micro y nanométrica es a menudo necesaria para descifrar diversos procesos celulares y moleculares...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en crear microentornos celulares para estudiar cuestiones biológicas relacionadas con los comportamientos celulares individuales y colectivos que ocurren en dimensiones a escala micro y nanométrica. Esto se logra primero diseñando plantillas que finalmente guiarán la colocación de las células. A continuación, estos diseños se traducen en superficies patrón mediante litografía por fotolitografía, lo que permite la creación de moldes de blindaje de plasma mediante litografía suave.Finalmente, estos moldes de blindaje se disponen en forma de trípode en una placa de Petri para permitir la exposición selectiva de las superficies subyacentes al plasma, lo que dejará un patrón químico sensible a las células en las áreas bajo cada molde. Los resultados pueden mostrar cómo el comportamiento de una célula depende de su microambiente y de su interacción con células vecinas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los efectos de los microambientes en el comportamiento celular, como, por ejemplo, ¿cómo afectan las interacciones entre grupos de células a fenómenos de orden superior?¿Y cómo afectan las señales a escala nanométrica subcelular funciones como la migración y la diferenciación celular? Primero, utilice pegamento instantáneo para fijar una lámina con patrón a un conjunto de láminas en blanco. A continuación, cree un recipiente de papel de aluminio ligeramente más grande que el conjunto de láminas, y lo suficientemente grande como para contener 30 gramos de poli(dimetilsiloxano) o PDMS.Coloque la pila de portaobjetos en el recipiente y luego vierta PDMS sobre la pila de portaobjetos para crear un molde inicial. A continuación, desgasifique el PDMS colocando el recipiente dentro de una cámara de vacío. Rompa las burbujas presentes en el PDMS retirando y colocando rápidamente un dedo sobre el tubo de la válvula de entrada varias veces para permitir brevemente que el aire fluya hacia la cámara.La válvula permanece cerrada durante cinco minutos de desgasificación ininterrumpida. A continuación, deje que el PDMS se cure en la cabina de flujo limpio a temperatura ambiente durante uno o dos días. Una vez curado, el PDMS se desprende del patrón maestro, formando un molde.A continuación, vierta una capa delgada de seis gramos de epoxi de dos componentes que acaba de mezclarse durante un minuto en el molde maestro. Desgasifique inmediatamente el epoxi utilizando varios ciclos de eliminación de burbujas antes de que el epoxi se endurezca. Después de dejar reposar el epoxi desgasificado sin perturbar durante una hora, este se habrá curado parcialmente.Agregue más epoxi al molde sin desgasificar para producir una estructura más gruesa que será más fácil de manipular en los pasos posteriores. Luego, permita que el epoxi se cure durante uno o dos días. Una vez que el molde de epoxi esté curado, retire el epoxi del molde maestro de PDMS y luego envuelva cinta alrededor del molde de epoxi para formar un recipiente.Un molde funcional puede entonces crearse vertiendo PDMS sobre el molde de epoxi, desgasificando el PDMS y curando el nuevo molde durante uno o dos días. Después de que el molde funcional se haya curado, desprenda el molde del epoxi y almacene ambos moldes dentro de placas de Petri en un recipiente plástico sellado dentro de la cabina de flujo laminar para mantener la limpieza. Para preparar un molde para el estampado de superficies, corte secciones pequeñas del molde funcional con una cuchilla de afeitar y coloque las secciones en una placa de Petri.Las ubicaciones de estas secciones del molde se etiquetan en la parte posterior de la placa de Petri con un marcador permanente, dibujando un contorno alrededor de donde se sitúan las secciones del molde para formar un trípode a partir de las secciones y esperar al trípode para asegurar un contacto conformal entre el molde funcional y la superficie de la placa de Petri. Observar la parte inferior de la placa para confirmar una buena colocación, evidenciada por la presencia de canales que pueden verse a simple vista o con una lupa pequeña. Colocar el conjunto en una cámara de plasma.Inicie el tratamiento con plasma después del tratamiento con plasma. Retire el molde y la disposición de pesas, y coloque la placa de Petri dentro de una cabina de seguridad biológica bajo luz UV durante 10 minutos para esterilización. Almacene la placa allí hasta que se siembre con células.Diluya las células experimentales de elección en su medio de cultivo estándar para alcanzar la confluencia deseada. Cuando se coloquen sobre la superficie del plato de Petri patroneado, vierta tres mililitros de la solución celular en el plato de Petri. Incube el plato de Petri patroneado a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono, 100 % de humedad durante varias horas hasta varios días para permitir que las células se ensamblen sobre el patrón creado por la célula de plasma.El patrón se verifica mediante microscopía de contraste de fase. Al cultivar células de neuroblastoma, añada 10 micromoles de ácido retinoico diariamente hasta observar la diferenciación celular hacia un estado similar al de una neurona. Reemplace el medio de cultivo celular estándar cada tres o cuatro días.Un resultado típico de la implementación de la técnica de litografía por plasma es la formación de un patrón de células que se asemeja a alguna estructura arbitraria o natural. Un ejemplo de esto puede observarse en esta figura, con neuronas que han sido diferenciadas con ácido retinoico sobre un patrón de líneas. Y aquí en esta figura, donde se han creado líneas y redes de neuronas. También pueden utilizarse tipos celulares distintos de las neuronas, como se muestra en las siguientes dos figuras: esta figura muestra células endoteliales de vena umbilical humana, y esta figura muestra células musculares esqueléticas C2C12 formando cuadrículas, como se ve aquí.Los materiales como la polilisina también pueden ser configurados para facilitar la adhesión de ciertos tipos celulares y para otros usos. Tras seguir este procedimiento, se puede incorporar entradas adicionales, como microfluídica, sondas celulares o manipulación genética de proteínas específicas, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como: ¿cómo afectan las combinaciones de estímulos al comportamiento celular individual y de orden superior?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Se describen protocolos para sola neurona arraying microfluidos y el enmascaramiento de agua para el patrón de plasma en el chip de recubrimientos de biomateriales. Co-cultivos altamente interconectadas se pueden preparar usando entradas de celda mínimos.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

Este protocolo describe una metodología de bioimpresión que utiliza un sistema de depósito robótico automatizado que incorpora señales de guía topográficas grabadas con la deposición de precisión de una célula que contiene biotinta de hidrogel. Las células impresas se entregan directamente a las características grabadas y son capaces de detectar y orientarse con ellas.

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

Se presenta un protocolo para producir una gran área de sustrato nanomodelado a partir de pequeños moldes nanomodelados para el estudio de la modulación nanotopográfica del comportamiento celular.

La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

Este informe describe una técnica simple y fácil de realizar, utilizando vacío a baja presión, para llenar canales microfluídicos con células y sustratos para la investigación biológica.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Aquí presentamos un protocolo para área amplia exploración sonda Nanolitografía habilitado por el alineamiento iterativo de arreglos de discos de punta de prueba, así como la utilización de patrones litográficos para estudios de interacción de la superficie de la célula.

Área análisis sonda Nanolitografía facilitado por alineación automática y su aplicación a la fabricación de sustrato para estudios del cultivo celular

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.

Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional

Aprende la técnica de litografía de plasma para crear microambientes celulares que guían la colocación y comportamiento de células. Este método permite estudiar interacciones celulares y diferenciación en biomateriales.

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

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