Generación de un chip de barrera hematoencefálica utilizando células precursoras derivadas de iPSC

Tome un chip microfluídico con canales superpuestos recubiertos de matriz separados por una membrana porosa.

Semillas de células progenitoras neurales derivadas de iPSC en el canal superior. Incube para la adherencia celular, luego lave para eliminar las células sueltas.

A continuación, siembre células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC en el canal inferior.

Invierta el chip e incube para unir las células endoteliales al lado de la membrana del canal inferior.

A continuación, voltee el chip para unir las células al lado inferior del canal, formando una estructura monocapa en forma de tubo. Lave ambos canales con medios específicos para células.

Fluyen continuamente un medio de diferenciación neural en el canal superior y un medio de células endoteliales en el canal inferior.

Las células endoteliales utilizan factores de crecimiento desde el medio hasta la madurez y forman uniones estrechas que se asemejan a un vaso sanguíneo, formando el lado de la sangre.

Los factores neurotróficos impulsan la diferenciación de las células progenitoras neurales en varias células cerebrales, formando el lado del cerebro. Estas células interactúan con las células endoteliales, creando una barrera hematoencefálica en el chip.

Para comenzar, lleve el plato que contiene las papas fritas preparadas al gabinete de bioseguridad. Con una pipeta P200, lave suavemente ambos canales añadiendo 200 microlitros de medio de diferenciación neural en la entrada y extrayendo el líquido de la salida. Evitando el contacto con los puertos, aspire con cuidado el exceso de gotas de medio de la superficie del chip.

Agite suavemente la suspensión celular para asegurar una suspensión celular homogénea. Para sembrar las células progenitoras neurales derivadas de iPSC en el canal superior para generar el lado del cerebro, agregue una punta P200 que contenga de 30 a 100 microlitros de suspensión celular a una concentración de 1 x 10⁶ células por mililitro a la entrada del canal superior y suelte suavemente la punta de la pipeta.

Tome una pipeta P200 vacía para presionar el émbolo, insértela en la salida del canal superior y tire con cuidado de la suspensión unicelular a través de la punta. Transfiera el chip al microscopio para verificar la densidad de siembra en una distribución homogénea de las células dentro del canal superior. Después de confirmar la densidad celular al 20% de cobertura, coloque inmediatamente los chips en la incubadora durante dos horas a 37 grados centígrados.

Después de eso, lave las células que no se adhieren agregando medio de diferenciación neural fresco en la entrada y acumulando el líquido con una pipeta desde la salida. Mantenga las células en condiciones estáticas a 37 grados centígrados con un reemplazo diario del medio de diferenciación neural. Después de que los iNPC se hayan conectado o al día siguiente de la siembra, lleve el plato que contiene las papas fritas preparadas al gabinete de bioseguridad. Lave suavemente el canal inferior con 200 microlitros de medio de células endoteliales.

Evitando el contacto con los puertos, aspire cuidadosamente las gotas de exceso de medio de células endoteliales de la superficie del chip, asegurándose de dejar medio en ambos canales. Agite suavemente la suspensión celular para asegurar una suspensión celular homogénea. Con una pipeta P200, extraiga de 30 a 100 microlitros de la suspensión de células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC a una concentración de 14 a 20 x 10⁶ células por mililitro, y coloque la punta en la entrada del canal inferior.

El paso más crítico para lograr propiedades de barrera funcional es la siembra de células endoteliales microvasculares cerebrales. Es crucial sembrar las células a la densidad adecuada para evitar la formación de burbujas para verificar la distribución homogénea dentro de la vaina del órgano.

Presione el émbolo de una pipeta P200 con la punta vacía, insértelo en la salida del canal inferior y suelte lentamente el émbolo de la pipeta para tirar con cuidado de la suspensión unicelular a través del canal inferior. Aspire el exceso de suspensión celular de la superficie del chip. Evite el contacto directo con los puertos de entrada y salida para asegurarse de que no se aspire ninguna suspensión celular fuera de los canales. Transfiera el chip al microscopio para verificar la densidad de siembra.

El canal inferior está lleno de celdas sin espacios observables entre ellas. Después de confirmar la densidad celular correcta, siembre las células en los chips restantes. Para unir las células a la membrana porosa, que se encuentra en la parte superior del canal inferior, invierta cada chip y déjelos reposar en una base de chips. Coloque un pequeño depósito que contenga DPBS estéril dentro del plato de 150 milímetros para proporcionar humedad a las células.

Incube los chips a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres horas o hasta que las células del canal inferior se hayan adherido. Una vez que las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC se hayan adherido, voltee los chips a una posición vertical para permitir la unión celular a la parte inferior del canal inferior. 48 horas después de la siembra de las células endoteliales microvasculares cerebrales derivadas de iPSC, equilibre la temperatura del medio de las células endoteliales calentándolas en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora.

Luego, desgasifique el medio mediante incubación bajo un sistema de filtración accionado por vacío durante 15 minutos. A continuación, desinfecte el exterior del embalaje y las bandejas del módulo portátil con etanol al 70%, límpielos y transfiéralos al gabinete de bioseguridad. Abra el paquete y coloque los módulos en la bandeja. Oriéntelos con los depósitos hacia la parte posterior de la bandeja. Pipetee 3 mililitros del medio caliente preequilibrado a cada depósito de entrada. Agregue medio de cultivo de células endoteliales al depósito de entrada del canal inferior y medio de diferenciación neural al depósito de entrada del canal superior del canal superior.

A continuación, pipetee 300 microlitros del medio caliente preequilibrado a cada depósito de salida directamente sobre cada puerto de salida. Coloque hasta 6 módulos portátiles en cada bandeja. Lleve las bandejas a la incubadora y deslícelas completamente en el módulo de cultivo con el asa de la bandeja hacia afuera. Seleccione y ejecute el ciclo primario en el módulo de cultivo. Cierre la puerta de la incubadora y deje que el módulo de cultivo cebe los módulos portátiles durante aproximadamente un minuto.

El ciclo de preparación se completa cuando la barra de estado dice "Listo". Retire la bandeja del módulo de cultivo y llévela a la cabina de bioseguridad. Inspeccione la parte inferior de cada módulo portátil en el gabinete de bioseguridad para verificar que los módulos portátiles se cebaron con éxito. Busque la presencia de pequeñas gotas en los cuatro puertos. Si algún módulo portátil no muestra gotas, vuelva a ejecutar el ciclo primario en esos módulos. Si algún medio goteó sobre la bandeja, lo que ocurre con más frecuencia en los puertos de salida, limpie la bandeja con etanol al 70%.

A continuación, lave suavemente ambos canales de cada chip con medio de cultivo específico de células equilibrado y tibio para eliminar cualquier posible burbuja en el canal, y coloque pequeñas gotas de medios en la parte superior de cada puerto de entrada y salida. Inserte los chips con portadores en los módulos portátiles y coloque hasta seis en cada bandeja. Inserte las bandejas en el módulo de cultivo. Programe las condiciones apropiadas de cultivo de fragmentos de órganos, como el caudal y el estiramiento en el módulo de cultivo. Tan pronto como se completa el ciclo de regulación, que dura aproximadamente dos horas, comienzan las condiciones programadas. Después de eso, el módulo de cultivo comienza a fluir en las condiciones de cultivo de órganos y chips preestablecidas.