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Tome un embrión de ratón en un tampón y separe el cráneo para aislar el cerebro.
Retire las meninges, la capa membranosa que cubre el cerebro.
Diseccionar el cerebro para separar los hemisferios.
Aísle los telencéfalos dorsolaterales de los hemisferios y transfiéralos a un tubo.
Los telencéfalos dorsolaterales son ricos en neuronas y células progenitoras neurales.
Centrifugar y eliminar el sobrenadante.
Agrega una solución enzimática. Las enzimas descomponen la matriz del tejido, aflojando las células.
Introducir un medio de proliferación que contenga suero. Las proteínas séricas inhiben la actividad enzimática.
Use una pipeta para disociar mecánicamente el tejido, formando una suspensión celular.
Centrifugar y eliminar el sobrenadante que contiene enzimas inactivadas y restos de tejido.
Resuspender las células en el medio de proliferación.
Transfiera las células a una microplaca recubierta de sustrato de cultivo celular.
Incubar para que las células se adhieran al sustrato. El medio facilita la proliferación de células progenitoras.
Comience extrayendo los cerebros de 5 a 10 embriones E14 en una placa de Petri con medio de disección frío. Use fórceps para extraer con cuidado la piel y el cráneo y aislar los cerebros. Mientras trabaja bajo el microscopio estereoscópico, use pinzas de disección para extirpar las meninges. Luego, divida el telencéfalo por la mitad para separar los hemisferios.
Para aislar el corte de telencéfalo dorsolateral a lo largo de la curva dorsomedial y el límite palial-subpalial. Transfiera el telencéfalo dorsolateral a un tubo de 2 mililitros con medio de disección en hielo hasta que se diseccionen todos los cerebros. Después de la microdisección del telencéfalo dorsolateral, coloque el tejido en un tubo cónico de 15 mililitros.
Luego, centrifugar el tubo que contiene el tejido recolectado y el medio de disección en frío durante 5 minutos a 4 grados Celsius y 340 veces g para precipitar el tejido. Después del centrifugado, retire el sobrenadante con la pipeta y agregue 1 mililitro de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 grados Celsius para la digestión química. Incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, agregue 2 mililitros de medio de proliferación para inhibir la actividad de la tripsina. A continuación, pula la punta de una pipeta Pasteur de vidrio sobre un quemador de gas o un mechero Bunsen durante unos segundos para estrechar ligeramente la abertura. Aspire FCS para recubrir la punta de la pipeta. A continuación, disocie mecánicamente las células con la pipeta Pasteur pulida al fuego y recubierta de FCS pipeteando hacia arriba y hacia abajo teniendo cuidado de evitar que se generen burbujas.
Centrifugar las células disociadas durante 5 minutos a 4 grados centígrados y 340 veces g. Retirar el sobrenadante con una pipeta. Luego, agregue 1 mililitro de medio de proliferación y vuelva a suspender las células con una pipeta. Retire el PBS de la placa pretratada con poli-D-lisina. Luego, dibuje un letrero en la parte inferior de la placa que pueda usarse como referencia para determinar el punto cero.
Después de resuspender las células en medio de proliferación por segunda vez, prepare una dilución 1 a 1 de la suspensión celular con una solución de azul de tripano al 0,4%. Cargue en portaobjetos de la cámara de recuento y cuente el número de células viables sin teñir. Las células no viables serán azules. Diluir las células en medio de proliferación para obtener 106 células por mililitro. Agregue 500 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.