Establecimiento de un cultivo primario de células de ganglios de raíz dorsal a partir de una columna vertebral de rata

Tomemos una columna vertebral de rata. Realiza dos cortes a lo largo de sus lados y un corte lateral.

Retire los músculos dorsales y la porción dorsal de las vértebras.

Extraer la médula espinal.

Identificar los ganglios de la raíz dorsal, o GRD, ubicados bilateralmente a lo largo de las vértebras lumbares.

Los DRG contienen neuronas rodeadas de células gliales.

Extirpe los DRG y recójalos en un plato. Lave el pañuelo repetidamente con medios sin suero.

Transfiera los DRG a una placa que contenga una solución de colagenasa e incube. La colagenasa degrada la matriz extracelular.

Lavar con tampón. Agregue tripsina-EDTA e incube para interrumpir las uniones célula-célula, aflojando las células.

Transfiera los DRG a un tubo, centrifugue y deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender el tejido en medios de cultivo y pipetee repetidamente para liberar las células.

Transfiera las células a un pocillo de placa de cultivo recubierta de polímero para facilitar la unión.

Retire el medio y agregue medios nuevos que contengan inhibidores y factores de crecimiento.

Los inhibidores limitan la proliferación de células gliales, mientras que los factores de crecimiento promueven el crecimiento neuronal.

Recoja los ganglios de la raíz dorsal lumbar del tronco de una rata de dos a tres semanas. Comience haciendo dos cortes a lo largo de los lados de la columna vertebral y un corte lateral para marcar la extensión rostral de la columna lumbar. Luego, use pinzas para cortar huesos para extirpar los músculos dorsales de la columna vertebral. Luego, retire la porción dorsal de las vértebras y exponga la médula espinal, luego use tijeras de disección y fórceps para extirpar la médula espinal.

Identifique el DRG lumbar contando las vértebras de la última costilla. Este diagrama muestra las posiciones de las vértebras. Use microtijeras para recoger los 12 DRG lumbares bilaterales de L1 a L6. Retire las fibras neuronales adheridas para mejorar la pureza del cultivo. Transfiera cada DRG lumbar a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga 2 mililitros de medio helado sin suero.

Transfiera el plato de 35 milímetros que contiene DRG a una campana laminar y lave el DRG con medio sin suero tres veces con una pipeta. Use pinzas estériles para mover los DRG a una nueva placa de cultivo de 35 milímetros que contenga 2 mililitros de colagenasa estéril tipo 1A. Coloque el tejido en una solución de colagenasa en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius durante 30 minutos para comenzar la disociación de las células.

Después de la incubación, retire la solución de colagenasa y lave el DRG tres veces en 2 mililitros de la solución salina equilibrada de Hank. A continuación, agregue 2 mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% precalentado al plato y digiera el DRG en la incubadora durante 30 minutos como antes. Después de la digestión, use una pipeta de vidrio para transferir los 2 mililitros de solución que contiene DRG a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

El DRG puede adherirse a la pipeta de vidrio, por lo que este paso debe realizarse con cuidado. La pérdida de DRG se puede evitar manteniendo la solución que contiene DRG en el extremo cónico de la pipeta de vidrio y transfiriendo la solución al tubo de centrífuga lentamente pero sin pausa.

A continuación, centrifugar la solución a 290 veces g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Después de centrifugar, retire el sobrenadante y agregue otros 2 mililitros de medio sin suero para volver a suspender el DRG. Repita el lavado dos veces utilizando 2 mililitros de medio de cultivo precalentado para volver a suspender el tejido después de la centrifugación final.

Utilice la pipeta estéril pulida a la llama previamente preparada para triturar manualmente el DRG aproximadamente 60 veces. A continuación, retire de la incubadora de CO2 una placa de 24 pocillos recubierta de poli-L-lisina que contenga 1 mililitro de medio de cultivo por pocillo. Aspirar el medio de cultivo incubado de la placa.

Siembre las células DRG de una rata en cuatro de los pocillos. Esto da una densidad de siembra de aproximadamente 500,000 células por pocillo. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo con medio suplementado con 10 micromolares de AraC y 100 nanogramos por mililitro de NGF.