Infección de neuronas primarias del mesencéfalo de ratón con virus adenoasociados modificados

Comience con un cultivo de células embrionarias del mesencéfalo de ratón en un cubreobjetos.

Tratar con virus adenoasociados diseñados que codifican un complejo indicador de calcio fluorescente bajo un promotor específico de neuronas.

Incubar para la adhesión viral y la internalización.

Retire el medio para eliminar los virus no unidos, luego agregue un medio de cultivo e incube.

Los virus internalizados liberan su genoma en el núcleo, donde el promotor específico de la neurona impulsa la producción de complejos indicadores de calcio exclusivamente en las neuronas primarias.

Estos complejos incluyen una proteína fluorescente marcada con una proteína de unión al calcio y un péptido M13.

Transfiera el cubreobjetos a un plato con un tampón de grabación rico en iones de calcio, luego colóquelo en una cámara de grabación para obtener imágenes confocales en vivo.

Introducir un tampón de registro de glutamato, lo que hace que el glutamato se una a los canales iónicos, lo que lleva a la entrada de iones de calcio.

Estos iones se unen al complejo, provocando un cambio conformacional y una emisión de fluorescencia.

En imágenes en vivo, las neuronas brillantes indican la infección viral.

Comi