Infección de neuronas primarias del mesencéfalo de ratón con virus adenoasociados modificados

Comience con un cultivo de células embrionarias del mesencéfalo de ratón en un cubreobjetos.

Tratar con virus adenoasociados diseñados que codifican un complejo indicador de calcio fluorescente bajo un promotor específico de neuronas.

Incubar para la adhesión viral y la internalización.

Retire el medio para eliminar los virus no unidos, luego agregue un medio de cultivo e incube.

Los virus internalizados liberan su genoma en el núcleo, donde el promotor específico de la neurona impulsa la producción de complejos indicadores de calcio exclusivamente en las neuronas primarias.

Estos complejos incluyen una proteína fluorescente marcada con una proteína de unión al calcio y un péptido M13.

Transfiera el cubreobjetos a un plato con un tampón de grabación rico en iones de calcio, luego colóquelo en una cámara de grabación para obtener imágenes confocales en vivo.

Introducir un tampón de registro de glutamato, lo que hace que el glutamato se una a los canales iónicos, lo que lleva a la entrada de iones de calcio.

Estos iones se unen al complejo, provocando un cambio conformacional y una emisión de fluorescencia.

En imágenes en vivo, las neuronas brillantes indican la infección viral.

Comience preparando 1 mililitro de medio DMEM sin suero con 1 microlitro de hSyn-GCaMP6f AAV por plato. Aspire el medio de cultivo celular de cada placa y reemplácelo con 1 mililitro del DMEM preparado con hSyn-GCaMP6f. Vuelva a colocar los platos en la incubadora a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de la incubación, aspire el medio con AAV y reemplácelo con 3 mililitros de medio de cultivo celular. Incube los platos a 37 grados centígrados durante cinco a siete días, cambiando el medio cada dos o tres días durante este período de infección viral.

Prepare 1 litro del tampón de registro HEPES, 200 mililitros de tampón de registro de glutamato de 20 micromolares y 200 mililitros de tampón de registro NBQX de 10 micromolares, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.

Llene una placa de Petri estéril de 35 milímetros con 3 mililitros del tampón de grabación. Tome la placa de Petri con los cultivos infectados de la incubadora. Luego, agarre con cuidado el borde de un cubreobjetos con pinzas de punta fina y transfiéralo al plato con el tampón de grabación.

Vuelva a colocar el cubreobjetos restante en medio en la incubadora a 37 grados Celsius y transporte el plato con tampón de grabación al microscopio confocal. Inicie el software de imágenes. Mientras se inicializa, inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación. Luego, calibra el flujo a 2 mililitros por minuto.

Transfiera el cubreobjetos infectado de la placa de Petri al baño de registro con pinzas finas. Usando el objetivo de inmersión en agua 10x y la luz de campo brillante, encuentre el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos celulares neuronales. Luego, cambie al objetivo 40x y vuelva a enfocar la muestra.

Seleccione y aplique AlexaFluor 488 en la ventana de la lista de tintes. Para evitar la sobreexposición y el fotoblanqueo de los fluoróforos, comience con configuraciones de baja potencia de láser y HV.

Para el canal AlexaFluor 488, establezca el HV en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento en 0. Ajuste la potencia al 5% para la línea láser 488. Aumente el tamaño del orificio a 300 micrómetros y use la opción de escaneo "focus x2" para ajustar de manera óptima las señales de emisión a los niveles de subsaturación. La configuración se puede ajustar para una visibilidad óptima de cada canal.

Una vez que se optimizan los ajustes del microscopio, mueva la platina para localizar una región con múltiples células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia de GCaMP6f y concéntrese en el plano deseado para la obtención de imágenes.

Utilice la herramienta "Recortar rect" para recortar el fotograma de imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de un segundo. Establezca la ventana de intervalo en un valor de 1.0 y la ventana numérica en 600.

Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción "Tiempo". Luego, use la opción de escaneo "XYt" para comenzar a obtener imágenes. Observe la barra de progreso de imágenes y mueva la línea del tampón de registro HEPES al tampón de registro de glutamato de 20 micromolares en el punto de tiempo apropiado.

Cuando se complete la imagen, seleccione el botón "serie terminada" y guarde la película de la serie t terminada. Continúe perfundiendo el glutamato durante 5 minutos adicionales para que las neuronas cultivadas hayan estado expuestas al glutamato durante un total de 10 minutos. Repita este proceso para cada cubreobjetos que se vaya a fotografiar.