Desarrollo y mantenimiento de cuerpos embrioides libres de suero

Comience con una célula progenitora neural que contenga bien o agregados de NPC en medios diferenciadores-1 o DM-1.

Estas NPC son precursoras del linaje neural generado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos o hiPSC que utilizan DM-1 en condiciones controladas.

Transfiera los agregados NPC a un inserto de membrana colocado dentro de un pocillo que contenga DM-1 y elimine el exceso de medio.

Cambie el medio a DM-2 e incube.

La DM-2 proporciona nutrientes y factores de diferenciación que promueven la maduración de las NPC en diferentes tipos de células neuronales.

Los NPC indiferenciados se transforman en cuerpos embrioides, conocidos como cuerpos embrioides libres de suero o SFEB, ya que el medio carece de suero. Estos EB se asemejan a la morfología de un cerebro en desarrollo.

Transfiera el inserto a un pocillo que contenga DM-3.

La DM-3 contiene factores de crecimiento esenciales para el mantenimiento y crecimiento de los SFEB.

Incube hasta que los SFEB alcancen el tamaño deseado.

Después de dos semanas de cultivo de las células, prepare placas de seis pocillos con insertos de cultivo celular de 40 micras y 1 mililitro de medio DM1. Incube estas placas durante al menos cuatro horas antes de agregar las células cultivadas.

A continuación, con una punta de pipeta de boca ancha de 200 microlitros, recolecte agregados celulares de dos semanas con aproximadamente 20 microlitros de medio. Transfiera de cuatro a seis agregados a cada inserto con una solución mínima. Retire cualquier exceso.

Durante este paso, es importante trabajar rápidamente y con mano firme. Al eliminar el medio alrededor de los SFEB, es posible que vea que los SFEB se mueven a través de la solución debido a la tensión superficial. Está bien reposicionarlos después de quitar el medio.

Una vez que todos los agregados estén cargados en los insertos, cambie el medio a 1 mililitro de DM2 y continúe cultivando las celdas. Cada dos días, reemplace 3/4 del medio con medio fresco. Después de 14 días de cultivo, comience a agregar medio DM3 a los cultivos. Continúe el cultivo durante 16 días más para cultivar los SFEB.