Generación de un modelo de cocultivo 3D de fibroblastos y neuronas corneales humanas

Tomemos como ejemplo los fibroblastos corneales humanos.

Transfiéralos a un inserto de membrana dentro de una placa de pocillos múltiples que contenga medios.

Agregue medios al inserto de membrana. Incubar para la adherencia de fibroblastos al inserto.

A continuación, reemplace el medio con un medio que contenga vitamina C en el inserto de membrana y el depósito.

incubar. La vitamina C estimula a los fibroblastos para que secreten y ensamblen una matriz extracelular 3D.

Agregue una suspensión celular de neuroblastoma humano sobre los fibroblastos.

Incubar, permitiendo la adhesión celular del neuroblastoma.

Ahora, agregue medios que contengan ácido retinoico sobre las células y complemente el depósito con medios nuevos.

incubar. El ácido retinoico desencadena la diferenciación celular del neuroblastoma en células progenitoras neurales.

A continuación, retire el medio. Introduzca medios nuevos en el depósito. Agregue medios que contengan un factor neurotrófico al inserto de membrana e incube.

Los factores neurotróficos desencadenan la diferenciación de las células progenitoras en neuronas, generando un modelo de cocultivo 3D de fibroblastos y neuronas corneales humanas.

Para ensamblar construcciones 3D, primero, pase y cuente fibroblastos corneales humanos. Luego, siembre aproximadamente 1 vez 10 a los 6 HCF en un inserto de membrana de policarbonato con poros de 0,4 micras. Agregue 1,5 mililitros de medio fresco a la parte superior de la construcción. Luego, pipetea otros 1,5 mililitros del mismo medio en la parte inferior de cada construcción.

Después de 24 horas, agregue 1,5 mililitros de medio suplementado con 0,5 milimolar de vitamina C en la parte superior e inferior de cada construcción. Incube a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% durante tres semanas, agregando medios frescos que contengan vitamina C cada dos días. Esto estimulará a las células a secretar y ensamblar su propia matriz extracelular. Después de tres semanas, agregue 8 veces 10 a las 3 células de neuroblastoma humano SH-SY5Y en la parte superior de las construcciones 3D previamente ensambladas.

Es fundamental calcular el número exacto de células en este paso y dejar pasar 24 horas antes de iniciar la diferenciación celular.

Después de 24 horas de incubación, inicie la diferenciación celular SH-SY5Y estimulando las células con 1,5 mililitros de EMEM con 10% de FBS y 10 micromolares de ácido retinoico. Luego, agregue 1,5 mililitros del medio que contiene vitamina C en la parte inferior de la construcción. El ácido retinoico es sensible a la luz, por lo que este paso debe realizarse en la oscuridad.

Después de cinco días, cuando las células alcanzaron la fase de diferenciación, agregue 1,5 mililitros de medio sin suero que contenga 2 BDNF nanomolares y 1% de antibiótico-antimicótico en la parte superior de la construcción. Agregue un medio fresco suplementado con vitamina C en la parte inferior de la construcción. Cultive las células durante dos días adicionales antes de procesarlas para su posterior análisis.