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Coloque un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido fija en un tampón de recuperación de antígenos y caliéntelo.
La temperatura elevada y el pH alcalino del tampón rompen los enlaces cruzados de proteínas inducidos por la fijación, exponiendo los epítopos de antígenos.
Enfríe el portaobjetos para evitar daños tisulares inducidos por el calor, luego enjuague para eliminar el exceso de tampón.
Aplique una barrera hidrofóbica y coloque el portaobjetos en una cámara de humedad.
Agregue un tampón que bloquee la permeabilización. El detergente del tampón permeabiliza las membranas celulares y las proteínas bloqueadoras enmascaran los sitios de unión no específicos para reducir las manchas de fondo.
Elimine el exceso de tampón, agregue un cóctel de anticuerpos conjugados con metal e incube para permitir la unión de anticuerpos a antígenos específicos.
Lave el portaobjetos, eliminando los anticuerpos no unidos.
Agregue una tinción nuclear conjugada con metal que ingrese a las células y se una al ADN.
Enjuague el exceso de mancha y seque el portaobjetos.
Usando un escáner óptico, obtenga imágenes de alta resolución de las características estructurales del tejido, lo que ayuda a interpretar los datos del análisis de citometría de masas de imágenes de la muestra teñida.
Comience con una sección de tejido pretratada de cinco micrómetros montada sobre un portaobjetos compatible con inmunotinción. Coloque las diapositivas en un sobre de diapositivas.
Para la recuperación de epítopos inducida por calor o HIER, agregue tampón HIER en el sobre de portaobjetos hasta que el tejido esté completamente sumergido. Coloque el sobre deslizante en una cámara de desenmascaramiento e inicie el programa de calentamiento.
Después de que finalice el programa, coloque el sobre de diapositivas en una bandeja llena de agua fría y deje que se enfríe. Enjuague los portaobjetos con agua destilada varias veces aumentando gradualmente el volumen.
Retire las diapositivas del sobre para diapositivas y limpie el exceso de tampón. Para evitar la pérdida de tampón de bloqueo y anticuerpos, rodee el tejido con una pluma de barrera hidrofóbica.
Incube los portaobjetos en una cámara de humedad personalizada durante una hora. Para un bloqueo no específico, agregue un tampón de bloqueo a los portaobjetos en la cámara de humedad. Después del período de incubación, retire el exceso de tampón de bloqueo y deje que el tampón restante se seque al aire a temperatura ambiente.
Agregue con cuidado la solución de anticuerpos sobre el tejido e incube durante la noche en una cámara de humedad a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, lave el portaobjetos con PBS que contenga Triton durante 5 minutos. Finalmente, enjuague el portaobjetos dos veces con PBS durante 5 minutos cada uno. Ahora, trate el tejido con el tinte intercalador e incube en la cámara de humedad a temperatura ambiente durante treinta minutos.
Después de la incubación, lave el portaobjetos con agua de grado HPLC durante cinco minutos y séquelo en un desecador durante treinta minutos.
Una vez que la diapositiva esté seca, escanee con un escáner de documentos plano a una resolución no inferior a 1200 puntos por pulgada.