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Neurociencia
0 vistas • 3:45 min • July 8th, 2025
Tome un corte de tronco encefálico de ratón que contenga el núcleo vestibular medial o MVN.
Asegure la rebanada en una cámara de registro llena de líquido cefalorraquídeo artificial para mantener la viabilidad neuronal.
Visualice el corte bajo un microscopio para localizar las neuronas MVN.
Aplique presión positiva para hacer avanzar una micropipeta llena de una solución que imita el entorno intracelular a través del tejido.
A medida que la pipeta entra en contacto con una neurona, la membrana neuronal se hundirá.
Aplique presión negativa para aspirar una pequeña porción de membrana, creando un sello hermético.
A continuación, aplique pulsos de presión negativa para romper la membrana, creando una conexión continua entre la neurona y la pipeta.
Aplique amplitudes de ruido aleatorias a la neurona e identifique una amplitud por debajo del umbral más allá de la cual el ruido induce la activación neuronal.
Finalmente, aplique una variedad de estímulos eléctricos a la neurona combinados con la amplitud de ruido aleatorio subumbral.
Medir la ganancia neuronal: la capacidad de la neurona para modular su respuesta de disparo a los estímulos en presencia de ruido.
Para la electrofisiología de pinza de parche de células completas, primero, tire de las micropipetas con una resistencia final que oscilará entre 3 y 5 megaohmios cuando se llenen con una solución interna a base de potasio y colóquelas en el baño. Para obtener grabaciones de pinzas de parche de células completas de neuronas individuales en el MVN, transfiera una sola rebanada de tejido de la cámara de incubación a la cámara de registro de una configuración electrofisiológica estándar y use un hilo de nailon en un peso en forma de U para asegurar la rebanada.
Perfundir continuamente la cámara de registro con aCSF carbogenado a 25 grados Celsius a un caudal de tres mililitros por minuto, y llenar una micropipeta con solución interna. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con una pipeta para alejar los residuos de la punta de la pipeta. Usando un objetivo de menor potencia, ubique el MVN antes de cambiar a una alta potencia para ubicar neuronas individuales dentro del MVN.
Antes de romper el tejido con la pipeta, aplique una pequeña cantidad de presión positiva para alejar los desechos de la punta de la pipeta y use el micromanipulador para mover la pipeta hacia la neurona seleccionada. Se debe formar un pequeño hoyuelo en la membrana neuronal. Libere la presión positiva y aplique una pequeña cantidad de presión negativa.
Una vez que se haya logrado un sello de un gigaohmio, aplique una presión negativa suave, corta y aguda al soporte de la pipeta a través del puerto de succión para romper la membrana y crear una configuración de celda completa. Luego, obtenga registros de pinzas de corriente de celda completa de acuerdo con los protocolos estándar.
Para aplicar ruido estocástico y sinusoidal a las neuronas individuales del núcleo vestibular medial, establezca el rango de amplitudes de 3 a 24 picoamperios para determinar el umbral neuronal y la velocidad de disparo, y agrupe las intensidades de estímulo más bajas y más altas para determinar el umbral sensorial.
A continuación, calcule la velocidad de disparo promedio durante el período de 10 segundos durante el cual se inyectará el paso de corriente despolarizante para cada nivel de corriente individual. Utilice los valores de velocidad de disparo promedio para generar un gráfico de velocidad de disparo frente al actual. Luego, realice un análisis de regresión lineal para determinar el gradiente de la línea de mejor ajuste para determinar la ganancia neuronal.