JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 2:57 min • July 8th, 2025
Tome células ganglionares de la retina de pez cebra cultivadas en cubreobjetos recubiertos.
Estas células expresan un biosensor codificado genéticamente que produce la proteína fluorescente verde sensible a redox roGFP2 fusionada con una enzima sensible al peróxido de hidrógeno, Orp1.
Transfiera el cubreobjetos con medios a una cámara de imágenes de células vivas y coloque la cámara en un microscopio invertido.
Reemplace el medio con medios sin suero para reducir la fluorescencia de fondo.
Debido a los bajos niveles de peróxido de hidrógeno, roGFP2 permanece en su conformación reducida.
Excite el biosensor secuencialmente a longitudes de onda de 405 y 480 nm.
La roGFP2 reducida exhibe un pico de excitación a 480 nm.
Cambie a un medio que contenga peróxido de hidrógeno.
El peróxido de hidrógeno ingresa a las células y reacciona con Orp1, oxidando roGFP2.
Vuelva a excitar el biosensor.
La roGFP2 oxidada exhibe un aumento de fluorescencia a 405 nm y una disminución a 480 nm.
Calcule la relación de intensidad de fluorescencia.
Un aumento en la proporción indica un aumento de los niveles de peróxido de hidrógeno celular.
El día de la obtención de imágenes, verifique las células bajo el microscopio para validar el crecimiento de los axones RGC. Para obtener imágenes de células vivas, transfiera los cubreobjetos de la placa de cultivo a una cámara de imágenes de células vivas. Utilice un microscopio invertido equipado con un objetivo DIC, un filtro rojo de paso largo OG590 y una cámara EM-CCD.
Antes de la creación de imágenes, sustituya el medio ZFCM+ por ZFCM-. Después de colocar las células con el objetivo de 10x, adquiera imágenes con un aumento de 60x utilizando un objetivo de inmersión en aceite. Utilice un aumento adicional de 1,5x.
Primero, adquiera imágenes DIC, luego obtenga imágenes roGFP2-Orp1 utilizando un conjunto de filtros apropiado. Después de tomar el primer conjunto de imágenes, intercambie medios con medios que contengan diferentes soluciones de tratamiento. Los medios deben cambiarse cada 30 minutos de imágenes para evitar cambios en el pH y la osmolaridad.