Registro de corrientes de células enteras con resoplido de GABA en un corte de cerebro de ratón

Comience con un corte cerebral cortical prefrontal asegurado en un líquido cefalorraquídeo artificial, o aCSF, en la cámara de registro de una configuración de electrofisiología.

Este aCSF contiene un bloqueador de los canales de iones de sodio, que inhibe los canales de sodio en las neuronas.

Coloque una micropipeta de hojaldre llena de ácido gamma-aminobutírico, o GABA, sobre una neurona postsináptica.

Coloque una micropipeta de registro llena de solución iónica con un electrodo cerca de la misma neurona.

Aplique una succión débil para crear un sello hermético con un pequeño parche de la membrana neuronal.

Luego, aplique una succión fuerte para interrumpir la membrana parcheada, lo que permite el acceso al interior de la neurona.

Administra el GABA, un neurotransmisor inhibidor, que se une a un canal de cloruro activado por ligando en las neuronas postsinápticas.

Esto abre el canal y permite que los iones de cloruro entren en las neuronas, generando una corriente postsináptica inhibitoria.

A un voltaje constante, registre la corriente postsináptica. Un aumento en la corriente postsináptica inhibitoria refleja el papel de GABA en la inhibición de la actividad neuronal.

Transfiera una rebanada de cerebro a la cámara de grabación con una pipeta Pasteur con su punta fina cortada para adaptarse al tamaño de la rebanada. A continuación, coloque un ancla de rebanada de platino sobre la rebanada para sostenerla en la plataforma. Después de eso, llene las micropipetas de registro con solución interna y llene las micropipetas de soplo con GABA a 10 micromolares, 50 micromolares y 100 micromolares o aCSF como control del vehículo.

Para evitar el bloqueo con residuos, aplique una ligera presión positiva con una jeringa de un mililitro antes de sumergir el electrodo de registro en el aCSF. Bajo un microscopio, coloque el electrodo de registro y la micropipeta de soplo de modo que las puntas aparezcan en el centro del monitor. Luego, identifique una neurona objetivo. Ajuste el enfoque del microscopio mientras baja gradualmente la micropipeta de soplo y colóquela sobre la neurona de registro en un ángulo de 45 grados.

Mantenga la distancia entre la punta de la micropipeta de soplo y la neurona diana en el rango de 20 a 40 micrómetros. Lenta y cuidadosamente, acérquese a la neurona con el electrodo de registro y luego libere la presión positiva. Aplique una succión débil y breve a través del tubo conectado al soporte del electrodo para crear un sello de gigaohmio. Mantenga el voltaje a cero milivoltios.

Después de la formación del sello de gigaohmio, compense la capacitancia rápida y lenta de forma manual o automática. Luego, aplique una succión breve y fuerte a través del tubo para entrar en el modo de celda completa. Posteriormente, registre las corrientes IPSC evocadas en modo de pinza de voltaje.

Administre bocanadas de GABA individuales o emparejadas a través de la micropipeta de soplo controlada por un generador maestro de pasos de ocho voltajes. Cambie la duración de la bocanada para obtener los mejores resultados de corrientes IPSC evocadas y mida las corrientes IPSC evocadas.