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Tome un corte coronal de ratón transfectado inmovilizado en una cámara de registro perfundida con aCSF.
El corte contiene una población de neuronas piramidales dispersas que expresan una enzima diana y una proteína fluorescente.
Ensamble una pipeta de registro que comprenda una solución intracelular y un electrodo conectado a un amplificador para medir señales neuronales.
Identifique microscópicamente el área de tejido objetivo y localice una neurona fluorescente.
Aplique presión positiva a la pipeta para evitar obstrucciones y avanzar hacia la neurona objetivo.
La presión positiva provoca una ligera hendidura en la membrana neuronal al contacto.
Libere la presión, formando un sello hermético entre la membrana y la punta.
Establezca el potencial de retención en un valor negativo constante para estabilizar la neurona.
Aplique una breve presión negativa para romper la membrana, conectando el citoplasma al interior de la pipeta y estableciendo una configuración de células completas.
Cambie al modo de pinza de corriente y aplique pulsos de corriente positivos, generando potenciales de acción indicativos de excitabilidad neuronal.
Transfiera una rebanada a la cámara de registro con una pipeta Pasteur o un cepillo pequeño. Mantenga presionada la rebanada con un arpa y perfunda con ACSF a una velocidad de 2 mililitros por minuto. Para parchear una neurona GFP positiva, localice el área de interés a través del microscopio a 10x. Luego, encuentre una célula GFP positiva usando el objetivo 60x.
A continuación, llene el electrodo de registro con solución intracelular. A continuación, coloque una pipeta de vidrio en el soporte de la pipeta. Después, coloca la punta de la pipeta en el baño y concéntrate en la punta. Una vez que la pipeta esté en el baño, aplique presión positiva a través del sistema de control de contrapresión.
Acérquese a la celda de interés bajo guía visual mientras mantiene la contrapresión en la pipeta. Ante la aparición de un pequeño hoyuelo en la superficie celular, libere la presión. En este punto, se puede formar un sello hermético con una resistencia superior a 1 gigaohmio. De lo contrario, aplique una ligera presión negativa para facilitarlo.
Mientras se forma el sello, lleve la pinza de voltaje de retención a menos 60 milivoltios. Una vez que se forma el sello de gigaohmio, aplique un pulso de succión para romper la membrana celular y entrar en el modo de célula completa. Una vez que esté en modo de celda completa, cambie del modo de pinza de voltaje al modo de pinza de corriente y comience a grabar.