Inducción de varices axonales con un estímulo micromecánico en las neuronas

Comience asegurando una micropipeta con un tubo conectado a un micromanipulador.

Conecte el otro extremo del tubo a una jeringa llena de un tampón de sal a través de un conector con una válvula giratoria.

Coloque la jeringa a una altura que proporcione suficiente presión para inducir varices en los axones.

Las varices axonales son hinchazones en forma de cuentas que ocurren a lo largo de un axón.

Coloque la micropipeta en el ángulo deseado en relación con la placa de cultivo.

Utilice la luz fluorescente del microscopio para alinear la punta de la micropipeta y bajarla cerca de la superficie de la placa de cultivo celular que contiene el tampón de sal.

Ahora, encienda la luz transmitida y apague el filtro fluorescente.

Coloque un cubreobjetos con neuronas en el plato.

Primero, concéntrese en la micropipeta y ajuste su posición.

Luego, concéntrese en la región que contiene las neuronas objetivo.

Abra la válvula para aplicar presión de fluido. Este estímulo micromecánico induce varices en estas neuronas.

En este procedimiento, inserte la pipeta en la parte superior del rosca del micromanipulador para mantenerla en su lugar. Incline la pipeta en un ángulo de 45 grados con la superficie de la placa de cultivo celular. Encienda el filtro de fluorescencia. Abra la abertura y asegúrese de que se pueda ver un punto fluorescente que atraviesa el objetivo.

Con el micromanipulador, mueva la pipeta a una posición que alinee la punta con el punto fluorescente y baje la pipeta a una posición justo por encima de la altura de la placa de cultivo celular. Una vez que esté en posición, encienda la luz transmitida y apague la fluorescencia. Con unas pinzas, transfiera un cubreobjetos con las células hacia la pipeta de la placa de cultivo celular a la placa de cultivo celular que contiene 2 mililitros de tampón de Hank a temperatura ambiente.

Usando la perilla de enfoque fino y el objetivo de 20 veces, enfoca en un plano de aproximadamente cuatro vueltas completas por encima de las celdas. Posteriormente, utilice el micromanipulador para colocar la punta de la pipeta de modo que quede enfocada y en el centro del lado izquierdo del plano, como se ve a través de los oculares. Una vez que la pipeta esté en posición, enfoque el microscopio en un plano que contenga la región de interés.

En las imágenes de 7DIV, las neuronas del hipocampo de ratón transfectadas con GFP mostraron un axón antes y después de la hinchazón.