Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 5:10 min. • July 8th, 2025
Coloque embriones de pez cebra genéticamente modificados bajo un microscopio estereoscópico y observe el enrollamiento espontáneo de la cola desencadenado por las neuronas motoras de la médula espinal.
Las propiedades intrínsecas de estas neuronas provocan la afluencia de iones a través de los canales de sodio, lo que conduce a la despolarización espontánea de la membrana y a la generación de potenciales de acción que se propagan a los músculos, desencadenando el enrollamiento de la cola. Mida la frecuencia de enrollamiento.
Transfiera algunos embriones a un bloqueador de los canales de sodio para inhibir la afluencia de sodio y evaluar la frecuencia reducida de enrollamiento.
Monte los embriones no tratados en agarosa fundida; deje que la agarosa se solidifique para restringir el movimiento y observe bajo un microscopio de fluorescencia.
Las neuronas motoras expresan un biosensor con un dominio de detección de voltaje unido a la membrana, o VSD, fusionado con fluoróforos donantes y aceptores.
La despolarización cambia la conformación del VSD, acercando los fluoróforos.
Tras la excitación, el donante transfiere energía al aceptor, provocando la emisión de fluorescencia del aceptor.
Agregue el bloqueador para inhibir la despolarización, lo que reduce la emisión del aceptor, lo que confirma la inhibición mediada por bloqueadores de la despolarización espontánea en las neuronas.
Para el análisis espontáneo de enrollamiento de la cola, transfiera los embriones a una placa de Petri redonda de 90 milímetros llena de agua de pescado que contenga 0,2% de DMSO y descorionarlos manualmente usando dos pinzas de joyero con puntas afiladas o agujas. Después, incubar los embriones durante 5 minutos a 28 grados centígrados. Usando una cámara digital montada en un microscopio estereoscópico, detecte el enrollamiento de la cola a temperatura ambiente durante una grabación de video de un minuto.
A continuación, adquiera la serie temporal con una resolución temporal de 30 fotogramas por segundo. Luego, calcule la frecuencia de enrollamiento espontáneo de la cola contando el número de curvas por unidad de tiempo. Para evaluar el efecto del fármaco riluzol, transfiera los embriones a una nueva placa de Petri de 90 milímetros llena de agua de pescado que contenga 5 riluzol micromolar. Luego, incube los embriones durante 5 minutos a 28 grados centígrados antes de grabar un video de un minuto y realizar el análisis de comportamiento.
Ahora, monte los embriones de 20 a 24 hpf en agarosa de bajo punto de fusión al 1% en agua de pescado dentro de un plato de imágenes con fondo de vidrio de 35 milímetros a 37 grados Celsius. Oriente los embriones de lado y espere hasta que la agarosa se solidifique a temperatura ambiente.
A continuación, transfiera el plato de imágenes a la platina de un microscopio confocal. Identifique las neuronas motoras que expresan el biosensor excitando Umikinoko-Green monomérico con láser de argón de 488 nanómetros. Luego, establezca su emisión entre 495 y 525 nanómetros y presione Grabar.
Para una medición FRET, excite mUKG, el donante del par FRET con un láser de 488 nanómetros. Simultáneamente, utilizando dos fotomultiplicadores, detecta la fluorescencia emitida por el donante y la fluorescencia emitida por el aceptor monomérico de Kusabira-Orange. Al comienzo del experimento, optimice la ganancia y el desplazamiento del fotomultiplicador 1, donde se registra la fluorescencia mUKG, y manténgalos constantes durante toda la sesión.
Para establecer el desplazamiento, cambie el color de la imagen a los valores de intensidad utilizando la tabla Q-lookup. Mientras escanea con un láser apagado, use el control deslizante de desplazamiento para que los píxeles de fondo tengan una intensidad ligeramente superior a cero. Usando la misma tabla de búsqueda, encienda el láser. Mientras escanea, use el control deslizante de ganancia para maximizar la relación señal-ruido, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados.
En la ventana de adquisición de software, seleccione el modo de adquisición xyt y un tamaño de campo de imagen de 512 por 64 píxeles en el menú desplegable. Luego, configure el registro de los cambios en el voltaje de la neurona espinal del embrión para adquirir un solo plano xy cada 30 milisegundos durante un minuto. Evaluar el efecto de la administración de riluzol sobre la despolarización de la membrana en la misma neurona, adquirir un nuevo conjunto de datos cinco minutos después de la adición de agua de pescado que contiene 5 riluzol micromolar.