Monitoreo de señales eléctricas de las neuronas aferentes en una larva de pez cebra inmovilizada

Comience con una larva de pez cebra inmovilizada y paralizada en una cámara de registro llena de una solución extracelular en una configuración electrofisiológica.

Llene una micropipeta aferente con la solución extracelular que contiene iones que proporcionan conductividad eléctrica para registrar la actividad neuronal.

Móntelo en un micromanipulador que contenga un electrodo de grabación conectado a un amplificador para la grabación de señales.

Aplique presión de aire positiva para evitar que la pipeta se obstruya.

Mueva la punta de la pipeta a lo largo del nervio de la línea lateral y colóquela adyacente al ganglio aferente que contiene un grupo de cuerpos celulares neuronales aferentes.

Los procesos celulares de estas neuronas están conectados a las células ciliadas ubicadas a lo largo de la línea lateral, que detectan los movimientos del agua.

A continuación, aplique una suave presión negativa para formar un sello suelto entre la micropipeta y el ganglio aferente.

Registre las señales eléctricas de las neuronas aferentes, que reciben la información sensorial de las células ciliadas en la larva inmovilizada.

Inmovilice las larvas de pez cebra y transfiéralas a una placa de Petri de 35 milímetros con una pipeta de transferencia de punta grande. Retire la mayor cantidad posible de la solución circundante. Sumerja las larvas en 10 microlitros de alfa bungarotoxina al 0,1% durante aproximadamente cinco minutos. Lave la larva paralizada con solución extracelular durante 10 minutos. Luego, use una pipeta de transferencia para mover la larva del baño de solución extracelular al plato de registro con fondo de silicona.

Bajo un microscopio estereoscópico, coloque suavemente las larvas con pinzas de punta fina sobre el centro de la estera de silicona, con el lado lateral hacia arriba con los extremos anterior y posterior del cuerpo de izquierda a derecha. Con pinzas de punta fina, inserte el pasador grabado ortogonalmente a la silicona a través de la notocorda dorsal de las larvas, directamente dorsal al ano. Inserte el segundo alfiler a través de la notocorda cerca del extremo de la cola e inserte el tercer alfiler a través de la notocorda dorsal de la vejiga de gas. Inserte el cuarto pin a través de la vesícula ótica mientras proporciona una ligera rotación a medida que el pin se inserta en el encapsulante.

A medida que se aplica una ligera rotación, observe si el tejido entre el cleithrum y la vesícula ótica revela el grupo de somata aferente. Coloque la lava clavada debajo del objetivo 10 veces en una platina fija del microscopio DIC y oriente las hendiduras mioseptales de los bloques musculares paralelas al vector de la etapa izquierda de la cabeza.

Coloque el cable de tierra en la solución de baño y asegúrese de que esté conectado a la platina de cabeza izquierda. Llene el electrodo de registro aferente con 30 microlitros de solución extracelular e insértelo en el soporte de pipeta de la platina de cabeza derecho. Luego, bájelo en la solución del plato mientras aplica presión positiva producida por un transductor neumático.

Localice el electrodo y coloque la punta del electrodo sobre la muestra. Con un micromanipulador, baje la punta del electrodo aferente hasta que se mantenga en posición por encima del cleithrum. Aumente el aumento a 40 veces la inmersión y localice la intersección del nervio de la línea lateral posterior y el clítoris. Lleve la punta del electrodo sobre el ganglio aferente y baje la pipeta hasta que la punta entre en contacto con el epitelio. Maniobra suavemente el electrodo para que toda la circunferencia de la punta entre en contacto con el ganglio aferente.