Un estudio electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón

Coloque una rebanada de cerebro de ratón en una cámara de grabación perfundida con una solución de grabación oxigenada.

La rebanada contiene el núcleo geniculado lateral dorsal, o dLGN, que es rico en neuronas de relevo. Estas neuronas forman sinapsis retinogeniculadas con las proyecciones de las células ganglionares de la retina y sinapsis corticogeniculadas con proyecciones neuronales de la corteza visual.

Coloque una pipeta estimulante en el tracto óptico para investigar las sinapsis retinogeniculadas o en el núcleo reticular del tálamo para investigar las sinapsis corticogeniculadas.

Coloque una pipeta de registro cerca de la rebanada. Usando un microscopio, ubique una neurona de relevo.

Aplique presión positiva para evitar la obstrucción de la pipeta mientras se acerca a la neurona.

Cambie a presión negativa, formando un sello con la membrana celular, luego rómpela para establecer continuidad con el citoplasma.

Usando la pipeta estimulante, administre pulsos eléctricos que inducen a las proyecciones a liberar neurotransmisores excitadores, que se unen a los receptores sinápticos de las neuronas relés, desencadenando el flujo de iones medido por la pipeta de registro.

En este procedimiento, tire de las pipetas de registro utilizando capilares de vidrio de borosilicato y un extractor de filamentos. A continuación, tire de las pipetas estimulantes con el mismo protocolo, pero rompa ligeramente la punta después de tirar para aumentar el diámetro. Posteriormente, llene las pipetas de registro con solución intracelular y biocitina y llene las pipetas estimulantes con solución de registro.

Luego, coloque las rodajas en la cámara de registro y perfunda continuamente con una solución de registro oxigenada a temperatura ambiente. Visualice los cortes con un microscopio vertical equipado con microscopía de video IR-DIC. Verifique todas las rebanadas y seleccione las que muestran tractos ópticos intactos. Coloque la pipeta estimulante en la rebanada antes de parchear la célula con la pipeta de registro.

Para investigar las sinapsis retinogeniculadas, coloque la pipeta estimulante directamente en el tracto óptico donde se agrupan las fibras axonales de las células ganglionares de la retina. Para analizar las sinapsis corticogeniculadas, coloque el electrodo estimulante en el núcleo reticular del tálamo, que está rostroventralmente adyacente al núcleo geniculado dorsolateral. Una vez que la pipeta de registro se sumerge en la solución de registro, aplique un paso de cinco milivoltios para controlar la resistencia de la pipeta.

Establezca el potencial de retención en cero milivoltios y cancele el potencial de compensación para que la corriente de retención sea cero picoamperios. Acérquese a la célula con una pipeta de registro mientras aplica presión positiva. Cuando la pipeta esté en contacto directo con la membrana celular, libere la presión positiva y ajuste el potencial de retención a menos 70 milivoltios.

Luego, aplique una ligera presión negativa para permitir que la membrana celular se adhiera a la pipeta de vidrio de modo que se forme un sello de gigaohmio. Compense la capacitancia de la pipeta y abra la celda aplicando pulsos de presión negativa. Para investigar la función sináptica, aplique pulsos de corriente de 0,1 milisegundos a través de la pipeta de estimulación. Monitoree la resistencia en serie continuamente aplicando un paso de cinco milivoltios.

La resistencia en serie se puede estimar dividiendo cinco milivoltios por la amplitud máxima de la corriente evocada. Utilice solo las celdas con una resistencia en serie inferior a 20 mega ohmios para el análisis.