Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:05 min. • July 8th, 2025
Tome un corte de cerebro de ratón transfectado inmovilizado en una cámara de registro de electrofisiología perfundida con aCSF oxigenado.
Esta rebanada contiene terminales axonales de neuronas talámicas que expresan canales iónicos sensibles a la luz fusionados con una proteína fluorescente.
Visualice los axones de las neuronas talámicas fluorescentes y seleccione una neurona piramidal.
Avance una pipeta de registro que contiene un electrodo en una solución intracelular hacia la neurona seleccionada con una ligera presión positiva.
La presión positiva crea un hoyuelo en la membrana neuronal al contacto.
Libere la presión para formar un sello de alta resistencia.
Establezca el potencial de membrana en un valor negativo constante.
Aplique un pulso de presión negativa para romper la membrana, logrando una configuración de celda completa.
Ilumina los terminales de los axones, activando los canales sensibles a la luz y despolarizando las membranas neuronales, desencadenando potenciales de acción.
Se liberan neurotransmisores excitadores, que se unen a los receptores de la neurona registrada, provocando la afluencia de cationes.
Registre las corrientes postsinápticas excitatorias resultantes, lo que indica una conexión sináptica directa entre las neuronas.
Para realizar el registro de pinza de parche de células completas, transfiera suavemente un corte de cerebro que contiene el complejo hipocampal a la cámara de registro. Perfunda continuamente la cámara de registro con 34 grados Celsius ACSF burbujeando con carbogeno a 2 a 3 mililitros por minuto. Examine brevemente la expresión de cronos GFP en terminales de axones en la región de interés con iluminación LED azul con un aumento de 4x.
Cambie a un objetivo de inmersión de 63x y ajuste el enfoque. Verifique si hay axones que expresen Chronos GFP y elija una neurona piramidal para la grabación de parches. A continuación, llene una pipeta con una solución interna a base de gluconato de potasio. Móntelo en el soporte de pipetas en la platina de cabezal. Parchee la celda en configuración de pinza de voltaje.
Acérquese a la neurona identificada y presione delicadamente la punta de la pipeta sobre el soma. La presión positiva debe producir un hoyuelo en la superficie de la membrana. Luego, libere la presión para crear un sello de giga ohmios. Una vez sellado, ajuste el voltaje de mantenimiento a menos 65 milivoltios.
Rompe la membrana con un pulso agudo de presión negativa. Registre en la pinza de corriente o voltaje las respuestas postsinápticas a la estimulación de campo completo del LED de 475 nanómetros de fibras aferentes que expresan cronos. Estimular con trenes de 10 estimulaciones de 2 milisegundos de duración a 20 hercios.