Determinación de un efecto de la hormona de crecimiento de prueba en las neuronas de kisspeptina utilizando una pinza de parche de célula completa

Asegure un corte hipotalámico de ratón transgénico en una cámara de grabación perfundida con aCSF.

La rebanada contiene neuronas kisspeptina que expresan proteínas de fusión fluorescente, cruciales para la regulación del sistema reproductivo.

Ensamble una micropipeta que comprenda un electrodo de registro en una solución interna.

Localice microscópicamente una neurona de kisspeptina fluorescente.

Aplique presión positiva a la pipeta y hágala avanzar hacia la neurona objetivo. Al contacto, la presión crea una hendidura en la membrana neuronal.

Aplique una breve presión negativa, formando un sello de alta resistencia entre la micropipeta y la membrana.

Establezca el voltaje de mantenimiento en el potencial de reposo fisiológico de la neurona para obtener mediciones precisas.

Aplique breves pulsos de presión negativa para romper la membrana, estableciendo una configuración de toda la célula.

Confirme la viabilidad de la neurona mediante el monitoreo de los parámetros.

Introducir una hormona de crecimiento de prueba, desencadenando vías de señalización e induciendo cambios en el potencial de membrana de la neurona.

Medir los cambios en el potencial de membrana para determinar el efecto inhibidor de la hormona del crecimiento sobre la actividad neuronal.

Transfiera una porción de cerebro de interés, una a la vez, a la cámara de grabación con una pipeta de transferencia acrílica. Sostenga la rebanada con un anclaje de rebanada para que no se mueva durante la perfusión de aCSF. Coloque el corte en el centro de la cámara de grabación utilizando la lente del objetivo de baja potencia del microscopio de inmersión 10x o 20x.

La posición del corte es fundamental para permitir una buena visión de la región deseada bajo el microscopio y para un alcance perfecto de la micropipeta de registro. Después de localizar la región de interés, cambie la lente del objetivo a la lente de alta potencia, 63x, y concéntrese en el nivel del tejido, observando la proteína fluorescente endógena y las formas de las células en la región objetivo para ubicar las células de kisspeptina en la superficie del corte cerebral.

Cuando se localice una posible celda objetivo, márquela en la pantalla de la computadora con el cursor del mouse o dibujando un formato como un cuadrado sobre el área de interés. La pantalla de la computadora marcada ayuda a guiar la posición de la micropipeta de registro hacia la célula. Después de determinar la ubicación exacta de la celda objetivo, levante el objetivo e introduzca la micropipeta de registro llena de la solución interna en el soporte del electrodo, asegurándose de que la solución interna esté en contacto con el electrodo de plata.

Aplique una presión positiva antes de sumergir la micropipeta en la solución de aCSF utilizando una jeringa llena de aire de 1 a 3 mililitros conectada al soporte de la micropipeta a través de un tubo de polietileno para evitar que entren residuos en la micropipeta. Con el micromanipulador, guíe la micropipeta por debajo del centro del objetivo. Mueva los botones del micromanipulador para guiar los ejes x, y, z de la micropipeta hacia la celda de interés.

Ajuste el enfoque para ver la punta de la micropipeta y acerque el enfoque, pero no demasiado al corte. Reduzca la velocidad del micromanipulador y baje lentamente la micropipeta al plano de enfoque, asegurándose de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en el corte, sino que descienda lentamente hasta tocar la superficie de la célula o la región objetivo.

Aplicando una ligera presión positiva con la jeringa llena de aire de 1 a 3 mililitros para eliminar cualquier residuo de la ruta de aproximación, mueva lentamente el micromanipulador en los ejes x, y, z para acercar la punta de la micropipeta y tocar la celda objetivo, lo que provoca un hoyuelo por la presión aplicada. Después de establecer el hoyuelo, con la ayuda del modo de pinza de voltaje en el software, aplique una succión breve y débil por la boca durante 1 a 2 segundos a través del tubo conectado al soporte de la micropipeta para generar el sello entre la micropipeta y la celda.

Si el sello permanece mecánicamente estable sin interferencias de ruido durante aproximadamente un minuto, ajuste el voltaje de mantenimiento al potencial de reposo fisiológico más cercano de la celda de interés. Para las neuronas hipotalámicas kisspeptina, se recomienda menos 50 milivoltios. A continuación, aplique una breve succión por la boca para romper la membrana plasmática en la punta de la micropipeta sellada colocada en la célula para que la membrana rota no obstruya la micropipeta ni atraiga una porción considerable de la membrana o la célula.

Se puede lograr una configuración adecuada de toda la celda realizando la succión con suficiente fuerza. Verifique el manual de configuración del sistema utilizado. Después de romper la membrana celular, habilite la opción Celda completa en el modo de pinza de voltaje y haga clic en el comando automático que se refiere a la pestaña Celda completa.

A continuación, verifique los parámetros de viabilidad celular en el software como se describe en el manuscrito del texto. Monitoree la resistencia de la serie y la capacitancia en estado estacionario de las celdas durante los experimentos. Una vez que la configuración de toda la celda se haya logrado correctamente, mida las corrientes sinápticas en modo de pinza de voltaje. Registre los cambios en el potencial de membrana en reposo y las variaciones inducidas en el potencial de membrana en reposo en el modo de pinza de corriente.