Registro de pinza de parche de célula entera en una neurona gelatinosa de una sustancia de un corte de médula espinal

Coloque una rebanada de médula espinal de rata en una cámara de registro y asegúrela con un anclaje de tejido.

Perfunda la rebanada con líquido cefalorraquídeo artificial.

Bajo un microscopio, identifique la sustancia gelatinosa translúcida o la región SG y seleccione una neurona SG sana.

Coloque una pipeta de parche llena de una solución iónica cerca de la neurona.

Aplique una presión positiva suave para eliminar cualquier residuo de la punta de la pipeta.

Mueva la pipeta hacia la neurona.

Luego, libere la presión positiva para formar un hoyuelo en la membrana neuronal, creando un sello.

Altere el potencial de retención para acercarlo al potencial de membrana en reposo, o RMP.

Use una succión breve para romper la membrana, estableciendo una configuración de célula completa.

En RMP, aplique pulsos eléctricos despolarizantes.

Estos pulsos abren canales de sodio dependientes de voltaje, lo que permite una rápida afluencia de iones de sodio.

Esta afluencia de iones desencadena un potencial de acción, lo que resulta en la activación de neuronas.

Registre los patrones de activación de neuronas.

Para realizar registros de pinzas de parche de células completas a partir de neuronas de sustancia gelatinosa o SG, use soluciones intracelulares a base de iones de potasio para el registro, mientras aplica una solución a base de cationes de cesio solo para el registro de corrientes postsinápticas inhibitorias.

Mueva suavemente el corte de la médula espinal a la cámara de grabación y luego estabilícelo firmemente con un alambre de platino en forma de U con hilos de nailon, para una estabilidad óptima del corte. Perfunda constantemente la rebanada con ACSF burbujeante a temperatura ambiente y ajuste la velocidad de perfusión de 2 a 4 mililitros por minuto para lograr suficiente oxigenación.

Luego, usando una lente de microscopio de baja resolución, identifique la región de las neuronas SG como una banda translúcida. Elija una neurona sana, caracterizada por una forma tridimensional con una membrana brillante y lisa, como célula objetivo, utilizando el objetivo de alta resolución, y ajústela al centro de la pantalla del monitor de video.

Llene una micropipeta con un volumen adecuado de solución intracelular a base de iones de potasio o de cesio. Luego, inserte la micropipeta en el soporte del electrodo y asegúrese de que la solución intracelular esté en contacto con el cable de plata dentro del soporte. Enfoca la micropipeta y usa el micromanipulador para sumergirla en el ACSF. Aplique una presión positiva suave para eliminar la suciedad y los escombros.

Mueva gradualmente la micropipeta hacia la neurona objetivo. Una vez que la pipeta se acerca a la neurona y se forma un hoyuelo muy pequeño en la membrana neuronal, libera la presión positiva para formar un gigasello. Altere el potencial de retención a menos 70 milivoltios, que está cerca del potencial fisiológico de membrana en reposo de una célula.

Luego, aplique una succión transitoria y suave a la micropipeta para romper la membrana y crear una buena configuración de células completas. Registre las propiedades de disparo probando el patrón de disparo de cada neurona en la pinza amperimétrica con una serie de pulsos de corriente despolarizante de un segundo de 25 a 150 picoamperios con incrementos de 25 picoamperios a potencial de membrana en reposo.