Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:35 min. • July 8th, 2025
Tome un corte de retina de ratón adaptado a la oscuridad dentro de una cámara de grabación en una habitación oscura. La retina se asienta sobre una base artificial de apoyo colocada sobre un cubreobjetos. Perfunda la rebanada con aCSF.
La red neuronal de la retina incluye fotorreceptores unidos sinápticamente a células bipolares que hacen sinapsis con las células ganglionares.
Coloque una pipeta de registro cerca de la retina.
Bajo un microscopio, aplique presión positiva mientras se acerca a una célula ganglionar objetivo.
Cambie a presión negativa para tirar de un parche de membrana, luego rómpelo para establecer continuidad con el citoplasma.
En la oscuridad, la membrana de los fotorreceptores permanece despolarizada, lo que lleva a la liberación de neurotransmisores.
Los neurotransmisores que se unen a los receptores celulares bipolares desencadenan el cierre del canal catiónico, inhibiendo la transmisión de señales.
Aplique un pulso de luz para hiperpolarizar los fotorreceptores. La disminución de la liberación de neurotransmisores desencadena la apertura del canal catiónico en las células bipolares.
La afluencia de cationes induce la liberación de neurotransmisores que se unen a los receptores de las células ganglionares, generando un potencial postsináptico excitador registrado por la pipeta.
Para grabaciones de pinzas de parche, cebe los tubos de perfusión con medio de Ames y deje que todas las burbujas pasen del tubo. Después de hacer pipetas de grabación con un extractor de vidrio, rellene la punta con solución de pipeta. A continuación, use un relleno de micropipeta para llenar aproximadamente un tercio de la pipeta. Una vez llena, guarde cada pipeta en una caja de pipetas húmeda.
A continuación, encienda el equipo para grabaciones de pinzas de parche, incluida la computadora, el amplificador, la cámara CCD y el microscopio. Trabajando en condiciones de oscuridad, coloque una preparación de corte de retina en la platina del microscopio con la ayuda de un visor infrarrojo. Después de inmovilizarlo, comience la perfusión continua.
Ajuste la temperatura de perfusión a 33 a 37 grados Celsius. Vea la superficie de corte con una cámara CCD. Concéntrese en la ubicación de destino donde residen los tipos de células de destino. Seleccione una celda de aspecto saludable para el registro de pinzas de parche. Una vez identificada una célula sana, coloque una pipeta de registro en un soporte para pipetas y avance la pipeta hasta la preparación de la rebanada.
Cuando esté cerca de la preparación de la rebanada, busque la punta de la pipeta con un microscopio. Una vez que la punta de la pipeta sea visible bajo el microscopio, mueva la punta hacia abajo hacia la célula diana. A continuación, configure el amplificador y ajuste la pipeta a picoamperios 5 voltios por nanoamperio. Inicie dos pulsos eléctricos continuos de aproximadamente 5 milivoltios y aproximadamente 10 hercios y verifique la resistencia de la pipeta.
Una resistencia ideal es de entre 5 y 12 megaohmios para la mayoría de las neuronas de la retina. Cuando esté listo, use una boquilla o jeringa para soplar la solución interna, hasta que la punta de la pipeta esté en la superficie de la célula objetivo. Cuando la presión positiva forme un pequeño hoyuelo en la superficie celular, avance ligeramente la punta y deje de soplar.
Si la resistencia de la pipeta aumenta continuamente, déjela y controle la resistencia hasta que alcance más de 1 gigaohm. Si la resistencia no aumenta espontáneamente, aplique suavemente presión negativa hasta que se convierta en un gigaseal. Una vez alcanzado el gigasello, cambie el potencial de retención a menos 70 milivoltios.
A continuación, aplique presión negativa de forma intermitente para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se realiza la configuración de celda completa, la resistencia de la pipeta puede estar entre 500 megaohmios y un gigaohm, y la corriente capacitiva es observable. Registre la relación I-V de menos 80 a 40 milivoltios. Se activarán diferentes tipos de canales activados por voltaje según el tipo de celda. Por último, registre las corrientes o voltajes sinápticos evocados por la luz.