Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:18 min. • July 8th, 2025
Comience con un pabellón auricular de ratón disecado, u oído externo, con sus nervios conectados expuestos.
Inserte el nervio destinado a la grabación en el electrodo de grabación.
Retire la capa de grasa cerca del margen del pabellón auricular para exponer la base del folículo piloso, luego doble la piel para exponer los pelos para estimularlos.
Coloque una sonda de estimulación mecánica para tocar y desviar los pelos.
Esta estimulación activa las terminaciones nerviosas sensoriales, abre canales iónicos activados mecánicamente, permite la afluencia de iones positivos y genera potenciales de acción.
Los potenciales de acción se propagan a través de estas terminaciones al nervio que se está registrando. Visualiza la señal.
A continuación, agrega un tinte fluorescente y continúa con la estimulación del cabello.
El tinte se une a las membranas neuronales estimuladas y se internaliza a través de la endocitosis sin afectar la actividad neuronal.
Después de la estimulación, lavar para eliminar el tinte no ligado.
Agregue un agente secuestrante para eliminar el tinte unido a la membrana no internalizado.
Usando microscopía de fluorescencia, visualice la tinción en los folículos pilosos para identificar terminaciones nerviosas estimuladas mecánicamente.
Para realizar registros controlados de los potenciales de acción evocados por estímulos, use una sonda mecánica de vidrio de microelectrodo de borosilicato de 10 centímetros pulido al fuego conectado a un actuador piezoeléctrico de cerámica. Coloque la sonda de modo que se mueva paralela al pliegue de la piel y toque los pelos, no la piel. Colóquelo entre medio y un milímetro por encima de la superficie de la piel. Luego, verifique manualmente la estimulación escuchando la salida de audio cuando la sonda se mueve.
Ahora, configure el software para impulsar la estimulación mecánica de un área pequeña de cabellos. Por ejemplo, programe estimulaciones de tres segundos a cinco sinusoides de Hertz cada 10 segundos. Esto requiere un desplazamiento de la sonda entre 200 y 2000 micras. Luego, proceda usando estimulación automatizada repetida para verificar la consistencia de las respuestas registradas en los nervios. Se deben lograr resultados repetibles.
Cuando los resultados sean consistentes, reduzca la tasa de repetición a cada 30 segundos. Se proporcionan más instrucciones en el protocolo de texto. Para investigar las propiedades de los canales mecanosensoriales y etiquetar los terminales mecanosensoriales alrededor de los folículos pilosos, agregue 10 micromolares FM143 a la solución y déjela actuar durante 60 minutos, mientras continúa estimulando los pelos con la sonda oscilante.
Este colorante bloquea los canales de transductores candidatos en las neuronas sensoriales en cultivo y en las células ciliadas de la cóclea. Sin embargo, no bloquea la activación en los aferentes del folículo piloso maduro in situ. El etiquetado de las terminaciones muestra que el tinte actúa como terminales, que continúan respondiendo a la estimulación mecánica durante la exposición al tinte.