Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:34 min. • July 8th, 2025
Tome una rebanada coronal del órgano vomeronasal quimiosensorial de un ratón transgénico que expresa neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia.
El epitelio sensorial contiene estas neuronas etiquetadas, que están expuestas a la luz conectada a la cavidad nasal para detectar señales químicas.
Asegure la rebanada en una cámara de imágenes con un anclaje de rebanada.
Transfiera la cámara a una configuración de registro y fluya una solución extracelular oxigenada para mantener la viabilidad del tejido.
Coloque una pipeta de perfusión cerca del corte para introducir estímulos químicos y una pipeta de registro sobre las neuronas sensoriales.
Usando un microscopio de fluorescencia, identifique las neuronas marcadas.
Aplique presión positiva para evitar la obstrucción de la pipeta y acérquese a una neurona hasta que se forme un hoyuelo en la membrana.
Cambie a presión negativa, introduciendo la membrana en la pipeta.
Aplicar succión para romper la membrana y establecer continuidad con el citoplasma, llamada pinza de parche de células completas, permitiendo la introducción de estímulos químicos y registrando las señales electrofisiológicas resultantes.
Transfiera una rebanada de VNO a la cámara de imágenes y fije la posición de la rebanada con un anclaje de acero inoxidable cableado con fibras sintéticas de 0,1 milímetros de espesor. No cubra la rebanada de tejido con ninguno de los hilos de fibra sintética. A continuación, transfiera la cámara de imágenes a la configuración de grabación y sobrefunda continuamente la rebanada con S2 oxigenado a temperatura ambiente.
Ajuste el capilar de succión a la superficie de la solución para crear un intercambio constante de solución de baño. Luego, ajuste el lápiz de perfusión de barriles múltiples 8 en 1 por encima y cerca de la parte no sensorial de la rebanada de VNO que contiene el vaso sanguíneo. Luego, conecte el electrodo de referencia y la solución de baño usando el puente de agar en forma de L lleno de cloruro de potasio de 150 milimolar.
A continuación, llene la pipeta de parche con solución de pipeta S4. Monte la pipeta sobre el electrodo recubierto de cloruro de plata conectado a la platina de cabeza sin raspar el recubrimiento y fíjela firmemente. A continuación, aplique una ligera presión positiva a la pipeta de parche antes de entrar en el baño. Supervise la pipeta y asegúrese de que esté entre cuatro megaohmios y 10 megaohmios.
Visualice el segmento de VNO con una cámara CCD utilizando DIC optimizado por infrarrojos e identifique células que expresan FPR-rs3-i-Venus, o neuronas marcadas de manera similar utilizando iluminación de fluorescencia y un cubo de filtro apropiado. Acérquese al cuerpo celular usando volantes para obtener la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, se hace visible una pequeña abolladura en la membrana del soma celular, una vez que la punta de la pipeta está muy cerca.
Luego, libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para succionar la membrana celular, con el fin de obtener un sello de alta resistencia de 1 a 20 giga-ohmios. Posteriormente, aplique una succión corta y suave para alterar la membrana celular y establecer la configuración de toda la célula.