Medición simultánea del calcio intracelular y del potencial de membrana en el endotelio cerebral de un ratón

Tome segmentos de una arteria cerebral posterior de ratón.

Incubar con una solución enzimática para degradar la matriz del tejido, aflojando las células.

Reemplace la solución con un tampón, luego transfiera un segmento a una cámara de grabación.

Disociar mecánicamente las capas de tejido conectivo y células de músculo liso, aislando el tubo endotelial subyacente.

Asegure el tubo, retire las capas disociadas y agregue un tampón fisiológico.

Coloque la cámara dentro de un sistema de registro con flujo amortiguador continuo.

Introduzca un indicador de calcio fluorescente que ingrese a las células endoteliales, luego inserte un electrodo de registro en una célula.

Administre un fármaco que desencadene la afluencia de iones de calcio e induzca una señalización posterior para la liberación de calcio del retículo endoplásmico.

El indicador se une al calcio y, tras la excitación, emite fluorescencia.

El aumento de calcio activa los canales de potasio dependientes del calcio, lo que provoca la salida de potasio y altera el potencial de membrana.

Registre simultáneamente los cambios en el calcio intracelular a través de la señal fluorescente y el potencial de membrana utilizando el electrodo.

En este procedimiento, prepare el aparato de trituración con un microscopio, una cámara y una platina de aluminio que contenga una cámara y micromanipuladores. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba adyacente a la platina y la muestra. A continuación, rellene completamente una pipeta de trituración con aceite mineral y asegúrela sobre el pistón de la microjeringa.

Luego, usando la microjeringa con controlador de bomba, extraiga aproximadamente 130 nanolitros de solución de disociación en la pipeta mientras se asegura la ausencia de burbujas de aire. Posteriormente, coloque los segmentos arteriales intactos en un mililitro de solución de disociación con las concentraciones requeridas de enzimas en un tubo de vidrio de 10 mililitros.

Incube a 34 grados centígrados durante 10 a 12 minutos para una digestión parcial. Después de la digestión, reemplace la solución enzimática con 5 mililitros de solución de disociación fresca. Con una pipeta de 1 mililitro, transfiera un segmento a la cámara que contiene la solución de disociación a temperatura ambiente.

A continuación, coloque la pipeta en la solución de disociación de la cámara y colóquela cerca de un extremo del recipiente digerido. Establezca una velocidad dentro del rango de 2 a 5 nanolitros por segundo en el controlador de la bomba para una trituración suave. Mientras observa a través de un aumento de 100 a 200 veces, retire y expulse el segmento arterial para disociar las células del músculo liso mientras produce un tubo endotelial.

Si es necesario, use con cuidado pinzas de punta fina para separar la adventicia disociada y la lámina elástica interna del tubo endotelial. Confirme que todas las células del músculo liso están disociadas y que solo las células endoteliales permanecen como tubo intacto.

Con micromanipuladores, asegure cada extremo del tubo endotelial en el cubreobjetos de vidrio de la cámara de superfusión con pipetas de fijación de vidrio de borosilicato. Lave las adventicias disociadas y las células del músculo liso de la cámara y reemplace la solución de disociación con dos milimolares de cloruro de calcio PSS.

Transfiera la plataforma móvil asegurada al tubo endotelial al microscopio de superfusión y al equipo experimental. Luego, use seis depósitos limpios de 50 mililitros para la administración continua de PSS y las respectivas soluciones farmacológicas durante el experimento.

Utilice la válvula de control de flujo en línea para ajustar manualmente el caudal tan constante como el flujo laminar mientras hace coincidir la alimentación de flujo con la succión al vacío. Administre PSS a la cámara para la superfusión del tubo endotelial durante al menos cinco minutos antes de registrar los datos de fondo y la carga de colorante.

Para medir el potencial de membrana simultáneamente con la concentración de calcio intracelular, tire de un electrodo afilado y rellénelo con cloruro de potasio de dos molares para registrar las células cargadas con colorante Fura-2.

Para estudiar el acoplamiento intercelular mediante transferencia de colorante, rellene el microelectrodo con yoduro de propidio al 0,1% disuelto en cloruro de potasio de dos molares. A continuación, coloque el electrodo sobre un alambre de plata recubierto de cloruro en el soporte de la pipeta unido a una platina de cabezal de electrómetro asegurada con un micromanipulador.

Utilice el micromanipulador para colocar brevemente la punta del electrodo en el PSS que fluye en la cámara mientras ve a través del objetivo de cuatro veces. Posteriormente, establezca el potencial de membrana en reposo en cero según sea consistente con el potencial de baño conectado a tierra.

Si lo desea, use monitores de línea de base audibles conectados a electrómetros para asociar el tono de sonido con posibles grabaciones. Luego, aumente el aumento a 400 veces usando un objetivo de 40 veces y coloque la punta del electrodo justo sobre una celda del tubo endotelial.

Ajuste la ventana fotométrica usando el software de fotometría para enfocar aproximadamente 50 a 80 células endoteliales. Luego, coloque suavemente el electrodo en una de las células del tubo endotelial usando el micromanipulador y espere al menos dos minutos para que se estabilice el potencial de membrana en reposo.

Una vez que el potencial de membrana en reposo sea estable en su valor esperado, encienda el tubo fotomultiplicador en la interfaz de fluorescencia en ausencia de luz y comience la adquisición de la concentración de calcio intracelular excitando Fura-2, alternativamente, a 340 y 380 nanómetros mientras recolecta la emisión de fluorescencia a 510 nanómetros.

Una vez establecidas las mediciones simultáneas del potencial de membrana y la concentración de calcio intracelular, espere unos cinco minutos para la superfusión del tubo endotelial con PSS a un caudal laminar constante antes de la aplicación de los fármacos.

Aplique el fármaco preparado en PSS a la cámara de superfusión a una velocidad de flujo constante. Durante el tratamiento farmacológico, mida el potencial de membrana en la relación F340/F380 simultáneamente. Una vez realizado el experimento, retire el electrodo de la celda. Luego, detenga los registros respectivos del potencial de membrana y la concentración de calcio intracelular y guarde los archivos para el análisis de datos.