Detección de respuestas fisiológicas de neuronas sensoriales en Drosophila

Coloque una Drosophila melanogaster modificada genéticamente anestesiada de lado en un cubreobjetos.

Extienda sus patas delanteras y asegúrelas para exponer los segmentos tarsianos.

Estos segmentos tienen neuronas gustativas que expresan complejos indicadores de calcio que emiten fluorescencia en forma unida al calcio.

Dibuja una barrera hidrofóbica alrededor de la mosca para retener la solución.

Deje que la mosca se recupere y superponga una solución salina tamponada sobre los segmentos tarsales expuestos para humedecerlos.

Bajo un microscopio confocal, observe los segmentos tarsianos y obtenga imágenes de las neuronas gustativas a varias profundidades para obtener una fluorescencia previa a la estimulación.

Agregue una solución de estimulación que contenga ligandos lipofílicos en el segmento.

Estos ligandos se unen a los receptores de las neuronas gustativas, iniciando vías de señalización y desencadenando la apertura de los canales de calcio.

Esto permite que los iones de calcio del líquido extracelular ingresen al citoplasma y se unan a los complejos indicadores de calcio, lo que resulta en una emisión de fluorescencia.

Cuando se observa nuevamente, un aumento en la fluorescencia neuronal confirma la respuesta fisiológica neuronal al ligando.

Después de anestesiar la mosca, colóquela en un cubreobjetos de 0,17 milímetros, usando una gota muy pequeña de esmalte de uñas transparente. Fije el lado de la mosca a la diapositiva usando toda la caída. Luego, bajo un microscopio de disección, use un pincel húmedo para extender una pata delantera de la mosca. Luego, usando dos tiras muy delgadas de cinta, asegure el primer y quinto segmento tarsiano al cubreobjetos.

Si se van a obtener imágenes de las neuronas en la probóscide, coloque otra tira delgada de cinta adhesiva sobre el rostro de la probóscide para exponer el labelo. Ahora, haz una pared corta alrededor de la mosca con un bolígrafo PAP. Deje que la anestesia desaparezca durante media hora antes de tomar medidas. Para este protocolo, prepare las diluciones necesarias de la solución de ligando de stock de 1 miligramo por mililitro utilizando PBST.

Para comenzar el procedimiento, superponga 10 microlitros de PBST en los segmentos tarsianos asegurados y expuestos. Esto humedece la pierna y evita que se desenfoque. A continuación, concéntrese en los segmentos utilizando un sistema óptico que pueda lograr una buena señal de fluorescencia con una resolución de tiempo rápida, como un microscopio confocal de disco giratorio con una cámara sCMOS. Recoge tres pilas Z de preestimulación de las neuronas de interés en el segmento tarsiano.

En este ejemplo, las imágenes se capturan con exposiciones de 200 milisegundos y un binning de 2 por 2 sobre una sección de 6 micras por 1/2 micras cada dos segundos. Asegúrese de optimizar la potencia del láser para minimizar el fotoblanqueo, al tiempo que permite una alta relación señal-ruido. Aquí, un láser de 491 nanómetros y 100 milivatios funciona con una transmisión del 30%.

La señal debe ser detectable antes de la estimulación, pero no acercarse a la saturación. Ahora, pipetee 10 microlitros de solución de estimulación en el segmento tarsiano de interés. Mientras pipetea, tenga mucho cuidado de evitar tocar la pata o cualquier parte del cuerpo de la mosca, o los tarsos se moverán fuera de posición. Luego, adquiera inmediatamente las primeras imágenes posteriores a la estimulación y continúe recopilando suficientes imágenes para documentar el cambio máximo en la fluorescencia.