Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:43 min. • July 8th, 2025
Comience con larvas de Drosophila, con fibras musculares y nerviosas expuestas sumergidas en una solución que contiene vesículas de tinte de membrana fluorescente o tinte FM.
El colorante FM se une a los lípidos de la membrana celular, formando una capa fluorescente sobre ella.
Con una unidad de micromanipulador, coloque la punta del microelectrodo de succión bajo un microscopio.
Concéntrese en las fibras nerviosas y el microelectrodo.
Use presión negativa para succionar un bucle de la fibra nerviosa en el microelectrodo.
Aplique pulsos de corriente para estimular la fibra nerviosa.
Esto desencadena la unión neuromuscular, donde una neurona motora se conecta a una fibra muscular, para iniciar la endocitosis de vesículas sinápticas.
Durante este proceso, la célula envuelve la membrana recubierta de tinte FM para formar vesículas endocíticas teñidas, ideales para visualizar etapas presinápticas de neurotransmisión.
Lave el tinte FM y reemplace la solución externa.
Aplique pulsos de corriente para descargar las vesículas teñidas con tinte FM de la célula.
Para la estimulación eléctrica, prepare una pipeta de succión con el extractor de microelectrodos para obtener el tamaño de cono y punta requeridos. Luego, pula a fuego la punta del microelectrodo con una microforja para crear un ajuste apretado al aspirar un solo nervio motor.
Deslice la pipeta de succión sobre el soporte del electrodo en un micromanipulador, que está conectado a un tubo de plástico largo y flexible y una jeringa. A continuación, coloque la preparación con colorante FM en la platina del microscopio y levante la platina hasta que la larva y la pipeta de succión estén enfocadas.
Luego, aspire un bucle del nervio motor cortado, inervando el hemisegmento seleccionado con presión de aire negativa generada por la jeringa en el electrodo de succión. Posteriormente, estimular el nervio motor utilizando los parámetros seleccionados para impulsar la endocitosis SV y la absorción del colorante FM1-43.
El paso más crítico en este punto del procedimiento es aspirar un solo axón motor en el electrodo de succión con un ajuste apretado. Esto puede requerir un poco de prueba y error. Una vez que se encuentre un electrodo de succión adecuado, use el mismo para todas las condiciones que se comparan para garantizar una fuerza de estimulación constante.
Para la descarga del tinte FM, succiona el mismo nervio motor en el mismo electrodo y luego estimula el nervio motor para activar la exocitosis SV y la liberación del colorante FM1-43.