Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:50 min. • July 8th, 2025
Coloque un cultivo de cuerpos celulares de neuronas sensoriales del oído interno en una cámara de registro.
Llene frontalmente una pipeta de pinza de parche con una solución interna.
Rellene con la misma solución que contiene un antibiótico perforante de membrana, lo que permite que llegue gradualmente a la punta.
Llene dos tercios de la pipeta con la solución antibiótica, insértela en un soporte que contenga un electrodo de registro y bájela en la cámara.
Visualiza bajo un microscopio para acercarte a una neurona.
A medida que la punta de la pipeta entra en contacto con la neurona, la superficie neuronal forma un hoyuelo y la resistencia aumenta.
Aplique presión negativa para formar un sello hermético entre la pipeta y la membrana.
Mantenga el potencial de retención cerca del potencial de membrana en reposo.
El antibiótico perfora la membrana, permitiendo el movimiento de iones entre la célula y el electrodo para establecer un entorno iónico estable.
Aplique pasos de voltaje para abrir canales iónicos activados por voltaje, lo que permite la entrada de iones y genera corrientes proporcionales a la función del canal iónico, que son registradas por el electrodo.
Sumerja la punta de la pipeta en la solución limpia de la placa de cultivo para llenarla con una solución limpia que no contenga anfotericina. Llene la parte posterior de la pipeta con la solución interna que contiene anfotericina. Vuelva a sumergir la punta de la pipeta en la solución limpia de la placa de cultivo mientras la anfotericina entra lentamente en la punta desde la parte posterior de la pipeta. A continuación, termine de llenar la pipeta con la solución de anfotericina hasta 2/3 de la pipeta.
Baje la pipeta en el baño de la cámara de registro y ubique la punta de la pipeta en el medio del campo de visión. Asegúrese de que la punta esté libre de burbujas de aire u otros residuos. Coloque la pipeta cerca de la membrana y aterrice firmemente en el centro de la celda. Aplique presión negativa o succión con una jeringa o pipeta bucal.
Encienda el potencial de retención de menos 60 milivoltios. La resistencia del sello debe aumentar hasta que pase un gigaohm. Una vez que se forme un sello de gigaohmio, libere la presión negativa. La anfotericina comienza a funcionar. La resistencia de entrada disminuye lentamente y la corriente que fluye en respuesta al paso de voltaje de 5 milivoltios aumenta progresivamente a medida que la anfotericina ingresa a la membrana.