Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

Asegure un corte de cerebro con la región objetivo en una cámara de registro.

Coloque una pipeta de registro que contenga una solución interna sobre una neurona postsináptica y logre una configuración de célula completa.

Introduzca una pipeta de parche de búsqueda cerca de una neurona presináptica.

Esta pipeta está llena de una solución a base de sodio para evitar la despolarización de las neuronas mientras se busca la célula presináptica.

Utilice una succión suave para establecer una configuración de sellado suelto con la pipeta de búsqueda.

Mantenga el potencial de membrana y aplique grandes pulsos de corriente para desencadenar un potencial de acción en la neurona presináptica.

Monitoriza la respuesta postsináptica a esta estimulación.

Si no se detecta respuesta, parchee otra neurona presináptica y repita la estimulación.

Continúe este proceso hasta que se observe una respuesta en la neurona postsináptica.

Reemplace la pipeta de búsqueda con una pipeta de registro y establezca una configuración de célula completa en la neurona presináptica.

Aplique pulsos de corriente para provocar potenciales de acción en la neurona presináptica y registre la respuesta postsináptica.

Después de preparar rodajas de la región objetivo, déjelas incubar. Durante este tiempo, tire de las pipetas de parche, que deben tener un vástago largo y delgado. Después de asegurar un corte de cerebro con un arpa de platino en una cámara experimental, llene una pipeta de grabación con solución interna.

Coloque la pipeta en el preamplificador y conecte una neurona postsináptica putativa en modo de célula completa. Usando una pipeta de parche de búsqueda de resistencia de 8 a 10 megaohmios llena de una solución interna en la que las sales de potasio se reemplazan por sales de sodio, aplique una succión suave a la pipeta de búsqueda para parchear una posible neurona presináptica en una configuración unida de células sueltas.

Mantenga el potencial de membrana debajo del sello suelto entre menos 30 y menos 60 milivoltios en modo de pinza amperimétrica. Luego, aplique grandes pulsos de corriente de 0.2 a 2 nanoamperios para provocar un potencial de acción en la célula presináptica potencial.

Observe este potencial de acción como un pequeño pico encendido en la respuesta de voltaje. Establezca la frecuencia de estimulación en 0,1 Hertz para evitar el agotamiento de la respuesta postsináptica. Si la neurona postsináptica no responde a la estimulación de la neurona potencialmente presináptica probada, parchee una nueva neurona presináptica potencial en modo de sellado suelto.

Pruebe hasta 30 neuronas potencialmente presinápticas de esta manera, continuando usando el mismo electrodo de parche de búsqueda siempre que se pueda establecer un sello con una resistencia superior a 30 megaohmios.

Si la estimulación en el modo de sellado suelto da como resultado un EPSP o IPSP con una latencia inferior a cinco milisegundos en la neurona postsináptica, retire la pipeta de búsqueda de la neurona presináptica.

Usando un electrodo de parche de registro lleno de biocitina que contiene una solución interna regular con una resistencia de cuatro a ocho megaohmios, parchee la neurona presináptica y registre en modo de pinza de corriente de célula completa. Obtener potenciales de acción mediante inyección de corriente en las neuronas presinápticas y registrar la respuesta postsináptica.