Evaluación de sinapsis en cinta en regiones de frecuencia específicas de la cóclea de ratón

Comience con tubos que contengan giros cocleares de ratón pretratados con un agente permeabilizante y un agente bloqueador que eviten interacciones inespecíficas.

Cada giro detecta diferentes frecuencias de sonido y contiene células ciliadas que convierten el sonido en señales eléctricas. Estas señales se transmiten a través de neurotransmisores en sinapsis de cinta al nervio auditivo.

Retire la solución y agregue anticuerpos primarios que interactúan con las proteínas en el cabello y las células nerviosas en las sinapsis de la cinta, luego lave.

Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos rojos y verdes, que se unen a sus anticuerpos primarios.

Lavar para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.

Coloque la muestra en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje que contenga tinte nuclear para teñir los núcleos de azul.

Monte el cubreobjetos. Séquelo, luego use un microscopio confocal para obtener imágenes de cada segmento a varias profundidades.

Las sinapsis de cinta aparecen como puntos rojos y verdes colocados muy cerca.

Cuente estos puntos funcionales en cada turno para correlacionar su respuesta a la frecuencia del sonido.

Después de la disección, coloque cada giro coclear en tubos de centrífuga individuales de 2,5 mililitros. Bloquee cualquier unión inespecífica con suero de cabra al 10% en PBS en Triton X-100 al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente en un rotador.

Al final de la incubación, use una punta de pipeta de 200 microlitros para eliminar la solución bajo un microscopio de disección. Incube las muestras con los anticuerpos primarios de interés diluidos en suero de cabra al 5% en PBS y Triton X-100 al 0,1% durante la noche a 4 grados Celsius en un rotador.

A la mañana siguiente, enjuague las muestras de tejido tres veces durante 5 minutos con PBS frío 0,1 molares por lavado para eliminar cualquier anticuerpo primario residual. Luego, etiquete las muestras con los anticuerpos secundarios apropiados diluidos en suero de cabra al 5% en PBS y Triton X-100 al 0,1% durante dos o tres horas a temperatura ambiente en el rotador, protegido de la luz.

Al final de la incubación, lave las muestras tres veces con PBS 0,1 molares como se ha demostrado, y transfiera las muestras a placas individuales de 35 milímetros que contengan PBS 0,1 molares. Coloque una gota de medio de montaje suplementado con DAPI en el portaobjetos y transfiera las muestras de PBS al medio de montaje. Coloque un borde de un cubreobjetos en cada portaobjetos y suéltelo para que los cubreobjetos caigan suavemente. Luego, seque los portaobjetos en una caja de portaobjetos a 4 grados centígrados durante la noche.

Para obtener imágenes de las muestras, use un microscopio confocal con los láseres apropiados y una lente de inmersión en aceite de alta resolución de 63x. Adquirir pilas en Z confocales de 8 micrómetros de cada giro de cóclea. Para los recuentos de puntos sinápticos, establezca las pilas z con el tamaño de paso de 0,3 micrómetros para abarcar toda la longitud de las células ciliadas internas, asegurándose de que se puedan obtener imágenes de todos los puntos sinápticos, y combine las imágenes que contienen puntos en una pila para obtener la proyección del eje z.

Importe las imágenes combinadas a un programa de software de procesamiento de imágenes apropiado. Divida los recuentos totales sinápticos en cada pila z en regiones de frecuencia específicas por el número de células ciliadas internas positivas para DAPI para calcular el número de puntos sinápticos para cada célula. En cada región de frecuencia específica, promedie todos los puntos sinápticos en 3 imágenes de diferentes campos microscópicos que contienen de 9 a 11 células ciliadas internas.

Para visualizar mejor la arquitectura citoesquelética y la localización sináptica, use la herramienta de pincel para evaluar visualmente la estructura sináptica y la distribución de las células ciliadas internas individuales. Para inspeccionar la yuxtaposición de cintas presinápticas y parches receptores postsinápticos, use la herramienta de marquesina rectangular para extraer el espacio de vóxel alrededor de las cintas y use el corte de imagen para aislar las cintas individuales. A continuación, haga clic en Imagen y Tamaño de imagen para adquirir una matriz de miniaturas de estas proyecciones en miniatura que se pueden usar para identificar sinapsis emparejadas frente a cintas huérfanas.